第三章-细胞生物学研究方法-1-(2).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节 细胞形态结构的观察方法,一、光学显微镜技术(light microscopy),二、电子显微镜技术(Electro microscopy),三、扫描遂道显微镜(Scanning tunneling,microscope,STM),电子显微镜,扫描隧道显微镜,光学显微镜,0.1nm,1nm,10nm,100nm,1,m,100,m,1mm,1cm,10,m,(一)普通复式光学显微镜技术,一、光学显微镜技术,光学显微镜的组成部分：,照明系统，包括光源和聚光器；,光学放大系统，由物镜和目镜组成,机械装置，用于固定材料和观察方便。,（二）相差和微分干涉显微镜技术,相差显微镜（,phase contrast microscope,）：,1932,年,P,Zernike,发明，,1953,年,诺贝尔物理奖。,最大特点：可以观察,未经染色的标本和活细胞,。,基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。,相差显微镜与普通光学显微镜不同之处：,1.环形光阑(annular diaphragm):,位于光源与聚光器之间。,作用:使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。,2.相位板(annular phaseplate):,在物镜中加涂有氟化镁的相位板，将直射光或衍射光的相位推迟1/4。,A+相板：,将直射光推迟1/4，两组光波合轴后光波相,加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变,亮，形成亮反差（或称负反差）。,B+相板：,将衍射光推迟1/4，两组光线合轴后光波相,减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），,结构比周围介质更加变暗。,微分干涉显微镜（,differential interference microscope,）,1952,年，,Nomarski,发明，适于研究,活细胞中较大的细胞器。,优点,:,能显示结构的三维立体投影影像，立体感特别强，适合于显微操作,(,基因注入、核移植、转基因,),。,原理,:,利用两组平面偏振光的干涉，加强,影像的,明暗效果,能显示结构的三维立体投影。标本可厚一点，折射率差别更大，故影像立体感更强。,录像增差显微镜技术（,video-enhance microscopy,）,计算机辅助的,DIC,显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒细胞器的运动。,(三)荧光显微镜技术(Fluorescence Microscopy),原理与应用：,利用较短波长的光使样品受到激火，产生较长,波长的荧光，可作观察和分辩样品中产生荧光,物质的成分和位置。,包括：直接荧光标记技术,;,间接免疫荧光标记技术,在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性,定位：如绿色荧光蛋白,(GFP),的应用,Singapores National Institute of Education,UK,University of Florida,French,Singapore,South Korea,(四)激光共焦扫描显微镜技术（Laser Scanning Confocal Microscopy）,原理与应用：,利用共焦光路和激光扫描技术获取生物样品不同层面的图像，再通过计算机组合成三维重构的影像。,排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率,(1.41.7,倍,),，可重构样品的三维结构。,二、电子显微镜技术,（一）电子显微镜的基本知识,（二）主要电镜制样技术,（三）扫描电镜,Scanning electron microscope，SEM,Scanning probe microscope，SPM,（一）,电子显微镜的基本知识,显微镜,分辨本领,光源,透镜,真空,成像原理,LM,200nm,可见光,（400-700nm）,玻璃,透镜,不要求真空,利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化,TEM,0.2nm,电子束,（0.01-0.9nm）,电磁,透镜,1.33x10,-5,1.33x10,-3,Pa,利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差,1.电镜与光镜的比较,2.电镜与光镜光路图比较,3.电子显微镜的基本结构,Figure:Early images of cells.,(A)Drawings of a living plant cell(a hair cell from a,Tradescantia,flower),observed dividing into two daughter cells over a period of 2.5 hours by Eduard Strasburger in 1880.(B)A comparable living cell photographed recently through a modern light microscope.(B,courtesy of Peter Hepler.),（二）主要电镜制样技术,超薄切片技术(ultrathin section),：用于电镜观察的样本制备。,固定样品：锇酸和戊二醛,包 埋：环氧树脂，,进 样：以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，,切片厚度：4050nm，,染 色：采用重金属盐染色，以增大反差。,负染色技术（,Negative staining,）：,负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达,1.5nm,左右。,A,B,冰冻蚀刻技术（,Freeze etching,）,冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。,膜质双分子层的疏水断,铂,碳,快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching）,特点：,富有立体感,不需包埋,不需固定,保持样品的真实结构,主要用于观察胞质中的细胞骨架纤维及其结合蛋白,4.电镜三维重构技术,电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结,合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。,电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核,磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学 （Structural Biology）,主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的,主要实验手段,5.扫描电镜技术,扫描电镜(Scanning electron microscope，SEM),电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电,子，探测器收集二次电子成象。,CO,2,临界点干燥法防止引起样品变形的表面,张力问题,三、扫描遂道显微镜 （Scanning tunneling Microscope,STM）,(80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器),包括：SPM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等,原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。,装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。,分辩率：,0.1,0.2nm;,纵分辩率：,0.001nm,1000g,10min,20000g,20min,80000g,1h,150000g,1h,细胞匀浆 细胞核 线粒体、溶酶体、微体、高尔基体 沉淀含有,过氧化酶体,等囊泡,核糖体、,大分子 复合物,*g=1.12rn,2,10-5,r:半径;n:每分种旋转数(rpm),第二节细胞组分的分析方法,一、离心技术,用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物,差速离心,(differential centrifugation):,利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚组分和颗粒分开。,密度梯度离心,(density centrifugation):,不同组分以不同有沉降速率沉降，形成不同的沉降带。,沉降速率与物质的形态和大小有关，以沉降系数,(S,值,),表示。,CsCl,法,：,CsCl,可自行形成密度，所以不必特别制备密度梯度，只要将分离的样品与之混匀既可。在离心的过程中，具有不同密度的颗粒随,CsCl,密度梯度的形成重新分配；,蔗糖和甘油的最大密度为,1.3g/cm,3,，所以只能用于分离在,1.3g/cm,3,以下的细胞器或细胞结构；而,CsCl,的最大密度可达,1.9g/cm,3,以上，可用于分离密度大于,1.3g/cm,3,的,DNA,分子。,*在原理上,由于具有不同密度的颗粒随,CsCl,密度梯度的,形成重新分配,，所以又称为浮力密度离心；而蔗糖和甘油则是在被离心的物质在下降的过程中由于,密度的不同,而被阻止在不同的部位,故是重力密度离心。,密度梯度离心density centrifugation,二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法（细胞化学法）,原理,：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布与含量。,DNA分布：Feulgen反应,原理：切片先用稀盐酸处理使DNA，分子中脱氧核糖与嘌呤之间的连接键打开，形成醛基，再与Schiff 试剂作用使细胞核DNA显紫红色。,*Schiff试剂：无色亚硫酸品红复合物,多糖的存在：PAS（periodic acid Schiff reaction）,原理：过碘酸的氧化作用先使糖分子的,乙二醇,基,变为乙二醛基，后者继而与Schiff试剂结,合，形成紫红色反应产物。颜色反应的深,浅取决于组织内多糖的乙二醇分子的多寡。,蛋白质的检测：Million反应,原理：氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的酪氨,酸残基反应形成红色沉淀。,脂类脂类物质包括脂肪和类脂：,原理：标本用甲醛固定，冷冻切片，脂类保存较好。多用苏丹染料、油红O、尼罗蓝等溶于脂类的染料染色，使脂质呈色。也可用四氧化锇（O,S,O,4,）染色，脂肪酸或胆碱可使O,S,O,4,还原为O,S,O,2,而呈黑色。,三、特异蛋白抗原的定位与定性（免疫细胞化学）,免疫荧光技术（,Immunofluorescence,technique),：将免疫学方法与荧光标记技术相结合用来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。,特点：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。,蛋白电泳,(SDS-PAGE),与免疫印迹反应,(Western-Blot),。,Get one more technique molecular biological analysisSouthern hybridization,免疫电镜技术：,免疫铁蛋白技术,免疫酶标技术,免疫胶体金技术,应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等,体外培养的BHK21细胞经选择性抽提后用抗Mr280,103核骨架蛋白抗体进行免疫胶体金标记的结果,LYTU,Cell Biology,四、细胞内特异核酸的定位与定性,原位杂交技术,：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列要染色体上或细胞中的位置的方法称为原位杂交。,光镜水平的原位杂交技术（,in situ,hybridization,(同位素标记或荧光素标记的探针）,电镜水平的原位杂交技术（,in situ,hybridization）,（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）,PLETHORA proteins as dose-dependent master regulators of,Arabidopsis,root development,1、,PCR技术,对于已知全部或部分核苷酸序列的基因,可以通过聚合酶链反应(PCR),以基因组DNA或cDNA模板扩增得到目的基因片段。,2、实时定量PCR,(Real time quantitative PCR),实时荧光定量,PCR,定义：在,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个,PCR,进程，对起始模板进行定量分析的方法。,与普通PCR的区别,普通,PCR,技术：,在,PCR,结束后对,终点产物,进行定量分析。,实时定量,PCR,技术：,实时检测,PCR,扩增，在扩增的,指数期,对,起始模板,进行定量。,非特异性荧光标记：,（,1,）,SYBR,Green,特异性荧光标记：,（,2,）,TaqMan,（,3,）,Molecular,Beacon,1）DNA,产物的荧光标记,（1）SYBR,Green,法,工作机理,SYBR,Green,只有和双链,DNA,结合后才发荧光,；,变性时，,DNA,双链分开，无荧光,在延伸结束阶段采集荧光信号。,SYBR,Green,也能和非特异的双链,DNA,结合发光，所以,必须在反应结束时做熔解 曲线分析,。,SYBR,Green I,染料法,SYBR,Green I,荧光染料,在,PCR,过程中染料与,DNA,结合发光。,PCR,反应体系的建立及优化,SYBR Green,使用浓度,:,太高：抑制,Taq,酶活性，,太低,：,荧光信号太弱，不易检测,Primer,：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准,MgCl2,的浓度,:,可以降低到,1.5mM,以减少非特异性产物,反应,Buffer,体系的优化,反应温度和时间参数,:,由酶和引物决定,其他与常规,PCR,相同,SYBR,Green,法优缺点,优点,缺点,对,DNA,模板没有选择性,-,适用于任何,DNA,使用方便,-,不必设计复杂探针,非常灵敏,便宜,容易与非特异性双链,DNA,结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件,对引物特异性要求较高,（,2）TaqMan,法,TaqMan,探针,(,TaqMan,Probe),水解型杂交探针,TaqMan,探针是一段被设计成可以与靶,DNA,序列中间部位结合的单链,DNA(50-150bp),。,5-3-,端带有,短波长,和,长波长,的两个不同的荧光集团，因两个基团的距离很近，在,荧光共振能量转移,的作用下会发出荧光粗灭。,荧光共振能量转移技,(Fluorescence resonance energy transfer,FRET),检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具,检测某一细胞中两个蛋白分子是否存在直接的相互作用。,490nm荧光,供体,（CFP）,430nm激发光,受体,（YEP）,受体,（YEP）,490nm荧光,供体,（CFP）,430nm激发光,530nm黄色荧光,FRET,TaqMan探针的三个要素,1）一端的短波长的荧光集团,2）一段目的DNA特异碱基序列,3）一段长波长的荧光集团。,TaqMan,法,5,端标记有报告基团,(Reporter,R),，如,FAM,、,VIC,等,3,端标记有荧光淬灭基团,(Quencher,Q),探针完整，,R,所发射的荧光能量被,Q,基团吸收，无荧光，,R,与,Q,分开，发荧光,Taq,酶有,53,外切核酸酶活性，可水解探针,TaqMan,探针定量原理,TaqMan,法PCR反应的建立,1,、引物、探针的设计：探针,Tm,为,68-70,，,30 bp,5,不能有,G,，,G,可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段,400 bp,，引物,Tm,为,59-60、,2,、反应参数的确定：一般为：,95,3min,94,，,15S,60,，,60S,（,Taq,酶,53,外切酶活性在,60,最高也可通过温度梯度优化退火温度）,3,、优化引物和探针浓度：获得最小,Ct,值，最大信号,/,背景比值,引物浓度：,50-900nM,探针浓度：,50-250nM,4,、其他与常规,PCR,相同,40cycles,Taqman,法优缺点,优点,缺点,对目标序列的高特异性,-,阴性结果确定,引物设计相对简单,重复性比较好,只适合一个特定的目标,委托公司标记，价格较高,五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态,利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光,作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位,与半定位的一种细胞化学技术。,步骤:同位素标记的生物大分子前体掺入；细胞内,同位素所在位置的显示。,六定量细胞化学分析技术,利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些,物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。,包括：紫外光显微分光光度测定法,可见光显微分光光度测定法,流式细胞仪（,Flow,Cytometry,）,主要应用：用于定量测定细胞中的,DNA,、,RNA,或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离,DNA,含量不同的中期染色体。,第三节细胞培养、细胞工程与显微操作系统,一、细胞培养,动物细胞培养类型：,原代培养细胞(primary culture cell)：取下细胞、组织的器官后立即进行培养(1-10代以内)。,传代培养细胞（sub-culture cell）：适应在体外培养的持续传代培养的细胞。,细胞株(cell strain),:正常二倍体，接触抑制,细胞系(cell line),:亚二倍体，接触抑制丧失，色体明 显改变，容易传代培养。,常用的细胞系：Hela细胞系(子宫颈瘤细胞),BHK21(Baby hamster kidney),CHO(chinese hamster ovary),*培养细胞一般不保持体内原有细胞形态，存在形态：,成纤维样细胞(fibroblast like cell),上皮样细胞(epithelial like cell,培养方法：贴壁培养，悬浮培养,原代培养的步骤：,取组织块，剪碎，消化分散细胞连接处(胰酶或EDTA)，无菌、培养液中培养。,细胞系(Cell line),：在培养条件下可进行无限分裂的动物或植物细胞群。,细胞株(Cell strain),:通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志(Marker)的培养物称为细胞株，细胞株的特定性质功标志必须在整个培养期始终保持。,贴壁培养:分散的细胞悬浮在培养瓶中很快(几十分中至几小时)就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁，贴壁后的细胞形态形成多态，呈单层生长，所以此法又叫单层细胞培养。单层培养的细胞保持接触抑制特性。,悬浮培养:悬浮培养的细胞在培养过程中不贴壁，一直悬浮在培养液中生长。如T细胞的培养。悬浮培养条件较为复杂，难度也大一些，但是容易同时获得大量的培养细胞。,植物细胞,类型：单倍体细胞培养（花药培养）,原生质体培养（体细胞培养）,非细胞体系（,cell-free system,）,LYTU,Cell Biology,二、细胞工程,细胞分化的定向诱导：,基因工程 组织工程,细胞融合：,杂种细胞 单克隆抗体,显微注射,克隆动物,2.细胞融合技术：,脾细胞,(B淋巴细胞),骨髓瘤细胞,杂交瘤细胞,长命不分泌抗体,分泌抗体短命,分泌抗体长命,(Khler和Milstein,Jerne),1984年Nobel生理学及医学奖,3.杂交瘤细胞的筛选：,脾细胞,(B淋巴细胞),骨髓瘤细胞,杂交瘤细胞,脾细胞/,脾细胞,骨髓瘤细胞/,骨髓瘤细胞,骨髓瘤细胞,脾细胞,筛选出,不能长期存活,不能长期存活,HAT培养基筛选原理,DNA,内源性途径(主要途径,),谷氨酰胺 or,单磷酸尿苷酸,二氢叶酸还原酶,A,H,T,外源性途径(旁路途径),(Hypoxanthine Guznine Phosphoribosyl Transferase),次嘌呤,鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT),胸腺嘧啶激酶(Thymidine kinase,TK),B淋巴细胞：HGPRT,+,，TK,+,骨髓瘤细胞：HGPRT,-,，TK,-,存活,死亡,外源性途径(旁路途径),浆细胞自发或诱发突变,脾B细胞用SRBC免疫(注射X蛋白),不能在HAT培养基上生长的骨髓细胞,(带有X蛋白的抗体),细胞融合,转到HAT培养基上,非融合细胞死亡,杂交瘤细胞生长,在多孔塑料板孔内培养单个细胞,(HAT培养液),培养2周,杂交瘤细胞可继续繁殖,优良杂交瘤细胞,检测单克隆抗体,接种动物,大量生产单克隆抗体,细胞大量培养罐大量生产克隆抗体,冷冻保藏,淘汰不合格的细胞,亲代死亡,使用与蛋白质或脂质藕联的亲脂性或亲水性的荧光分子,如,GFP,LUC,等,检测活体表面或细胞内部的分子运动以及各种结构上分子动态变化率的大小。,原理：利用高能量激光束的照射使特定区域的荧光不可逆的猝灭。光漂白的恢复可通过非漂白区的荧光分子在膜上或胞质中运动至光漂白区来完成。,一、荧光漂白恢复技术(Fluorescence recovery after photobleaching,FRAP),第四节 细胞及生物大分子的动态变化,二、酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）,真核生物转录调控因子具有组件式结构（modular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域。,其中,DNA结合结构域,（binding domain，BD）和,转录激活结构域,（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。,DNA结合结构域（,BD）能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录。,由不同转录调控因子的,BD,和DNA转录激活结构域,AD,所形成的,杂合蛋白却能行使激活转录的功能,。,酵母双杂交系统应用,鉴定,新的蛋白与蛋白相互作用,鉴定,蛋白级联底物,鉴定,突变对蛋白与蛋白结合的影响,在,已知的相互作用中鉴定干扰蛋白质,(,反向双杂交系统,),酵母双杂交原理,用基因工程的方法，将,GAL4 AD,和,BD,分别克隆到不同的载体上，导入同一细胞株中表达，效应基因无法被激活。,如果把某个已知的靶蛋白基因克隆到,GAL4 DNA,结合结构域基因片段的下游，同时把可能表达与靶蛋白相互作用因子的细胞群体中的全部,cDNA,克隆到,GAL4,转录激活结构域基因片段的上游，就有可能通过特定细胞群体中靶蛋白及其合作伙伴的相互关系把,GAL4,蛋白的,AD,与,BD,结构域连成一个功能性转录因子，诱导报告基因表达。,BD,AD,杂合蛋白,激活转录功能,AD,AD:Activation domain DNA-BD:Binding domain,Promoter,RNA polymerse,A,B,C,主要实验过程如下：,（1）选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株SFY526或HF7c；（2）构建带有GAL1 UAS-启动子-lac Z（His3）的转化载体；（3）把已知的靶蛋白质编码基因克隆到pGBT9的多克隆位点上，把所有cDNA都克隆到pGAD424载体上，构成cDNA表达文库。（4）从大肠杆菌中分别提取重组质粒DNA，转化感受态酿酒酵母菌株。（5）将共转化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白的阳性菌落。,酵母双杂交模型,DNA-Binding,Domain,Bait Protein,Prey Protein,Transcription,Activating,Region,Reporter Gene,DNA-Binding Site,模型,三、荧光共振能量转移技(Fluorescence resonance energy transfer,FRET),检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具,检测某一细胞中两个蛋白分子是否存在直接的相互作用。,490nm荧光,供体,（CFP）,430nm激发光,受体,（YEP）,受体,（YEP）,490nm荧光,供体,（CFP）,430nm激发光,530nm黄色荧光,FRET,对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈,