分子生物学-基因工程和核酸杂交课件.ppt

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TCGAG,）,如：,BamH,（,G,GATC,C,）,Sau,3A,（,N,GATC,N,）。,由此产生的,DNA,片段可借粘性末端相互连接，在,DNA,重组时具有更大的灵活性。,12,1,）,DNA,聚合酶,和,Klenow,片段,大肠杆菌,DNA,聚合酶,（,E.Coli,DNA polymerase,）是单一多肽链的多功能酶，分子量为,103kD,，它具有,3,种酶活性：,5,3,DNA,聚合酶活性,3,5,核酸外切酶活性,5,3,核酸外切酶活性,2,、,DNA,聚合酶,13,5,3,外切酶,5,3,聚合酶,3,5,外切酶,(103kD),Klenow,片段,N C,5,3,聚合酶,3,5,外切酶,(68kD),35kD(,小,)68kD(,大,),N,枯草杆菌蛋白酶,DNA,聚合酶,14,补齐双链,DNA,的,3,末端，同时可使,3,末端,DNA,标记上同位素。,cDNA,克隆中，合成,cDNA,第二链。,DNA,序列分析。,Klenow,片段的主要用途,15,Taq DNA,聚合酶,（简称,Taq,酶）是一种耐热的,DNA,聚合酶，分子量为,65Kd,，最佳作用温度是,7080,，,Taq,酶具有,5,3,聚合酶活性,和依赖于聚合作用的,5,3,外切酶活性,。,Taq DNA,聚合酶可用于,DNA,测序及通过聚合酶链反应（,PCR,）对,DNA,分子的特定序列进行体外扩增。,2,）,Taq DNA,聚合酶,16,逆转录酶,（,reverse transcriptase,）,是依赖,RNA,的,DNA,聚合酶，它以,RNA,为模板，,4,种,dNTP,为底物，催化合成,DNA,，此过程称为逆转录过程。,逆转录酶是多功能酶。,RNA,指导的,DNA,聚合酶活性（,RDDP,）,核糖核酸酶,H,活性（,RNaseH,）,DNA,聚合酶活性（,DDDP,）,3,）逆转录酶,17,5,3,3,5,RNA,(,用 表示,),RNA,-,DNA,杂化分子,3,5,RNase,（,核酸酶,H,活性,),DDDP,（,DNA,聚合酶活性,）,4,种,dNTP,RDDP,（,逆转录酶,）,引物、,4,种,dNTP,病毒双链,DNA,用,表示）,（,cDNA,第二链,(complementary DNA,，,cDNA,),与病毒,RNA,互补的,DNA,(,用 表示,),5,3,3,5,5,3,5,3,18,末端脱氧核苷酰转移酶,（,terminal deoxynucleotidyl transferase,，,TdT,，简称末端转移酶）：,分子量为,60Kd,，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链,DNA,分子的,3,末端,-OH,上。,末端转移酶的功能主要有：,在载体或目的基因,3,末端加上互补的同质多聚尾，形成,人工粘性末端,，便于,DNA,重组连接。,用于,DNA 3,末端的同位素探针标记。,4,）末端脱氧核苷酰转移酶,19,(,A,、,G,、,C,、,T,),n,OH,5,3,5,3,OH,5,3,5,3,(,A,、,G,、,C,、,T,),n,Mg,2+,dNTP,n,ppi,Mg,2+,dNTP,n,ppi,5,3,OH,5,3,OH,5,3,5,3,(,A,、,G,、,C,、,T,),n,Co,2+,dNTP,n,ppi,Co,2+,dNTP,n,ppi,（,1,）底物是,单链,DNA,或有,3,突出末端,的双链,DNA,，需要,Mg,2+,。,（,2,）底物是,平端,或,3,凹端,的双链,DNA,，需要,Co,2+,。,(,A,、,G,、,C,、,T,),n,20,DNA,连接酶,（,DNA ligase,）,：称为基因工程的缝纫针，它的主要功能是,催化两个互补粘性末端或平末端双链,DNA,分子的,5,磷酸基团与,3,羟基形成,磷酸二酯键,，将具有相同粘性末端或平末端的,DNA,连接起来。,DNA,连接酶包括,大肠杆菌,DNA,连接酶,和,T,4,DNA,连接酶,两种类型。,3,、,DNA,连接酶,21,22,碱性磷酸酶,（,alkaline phosphatase,）,的作用是催化去除,DNA,、,RNA,或,dNTP,上的,5,-,磷酸基团,。主要用途有：,除去,DNA,片段上的,5,磷酸以防自身连接。,在使用,T4,多核苷酸激酶和,32,P,同位素标记前，从,RNA,或,DNA,上除去,5,端的,磷酸。,4,、碱性磷酸酶,5,-,p,CpGpC -OH,3,碱性磷酸酶,5,-CpGpC -OH,3,5,-,p,3,-,HO,5,-,HO,3,-,HO,23,5,、,T4,多核苷酸激酶,5-,CpGpC -OH 3,p,+,ADP,+,ATP,5-CpGpC -OH 3,T4,多核苷酸激酶,前向反应,：,交换反应,：,5-CpGpC -OH 3+ADP,-,32,P dATP,二硫苏糖醇,Mg,2,+,过量,ADP,T4,多核苷酸激酶,p*,+,ATP,24,核酸酶,S1,可水解双链,DNA,、,RNA,或,DNA-RNA,杂交分子中的,单链部分,。其主要作用有：,除去粘性末端以产生,平末端,。,除去,cDNA,合成时形成的,发夹结构,。,分析,RNA,的,茎环结构,和,DNA-RNA,分子的,杂交,情况。,6,、核酸酶,S1,核酸酶,S1,核酸酶,S1,核酸酶,S1,+,25,4.2,载体,载体,（,vector,）：指能携带外源,DNA,片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为,DNA,。,制备的目的基因或,DNA,片段必须与合适的载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达。,常用的载体有：质粒、噬菌体、粘粒、酵母质粒和病毒等。,26,1,、克隆载体,克隆载体,：,能将载体外源,DNA,在受体细胞中复制、扩增并产生足够量目的,DNA,的载体。,27,能,自我复制,并具较高的拷贝数。,分子量一般,10Kb,。,带有,遗传筛选,标记。,有适当的,限制酶酶切位点,，便于外源,DNA,的插入和筛选。,多克隆位点,（,multiple cloning sites,，,MCS,）：,载体上具有的多个限制酶的单一酶切位点。,克隆载体应具备的特征,28,1,）质粒克隆载体,质粒克隆载体的主要用途：,用于保存和扩增,2Kb,目的,DNA,。,构建,cDNA,文库。,目的,DNA,的测序。,作为核酸杂交时的探针来源。,29,pBR322,质粒克隆载体,pBR322,质粒是由一系列,大肠杆菌质粒,DNA,通过,DNA,重组技术构建而成的双链克隆载体，长为,4.36Kb,。,它含有一个能保证高拷贝自我复制的,复制起始点,（,Ori,），并装有,四环素抗性（,Tet,r,）基因,和,氨苄青霉素抗性（,Amp,r,）基因,供菌落筛选。,在这两个抗性基因中分别含有,BamH,I,和,Pst,I,等限制酶的,单一酶切位点,，用于插入外源,DNA,片段。如有外源基因的插入，会导致这些标志性基因的失活。,30,复制起始点,抗药基因,抗药基因,pBR322,载体,31,pUC,系列载体,pUC,系列载体是由,pBR322,质粒和,M13,噬菌体重组构建而成的,双链,DNA,质粒,载体。,pUC18,和,pUC19,质粒长约,2.69Kb,，除多克隆位点互为相反方向排列外，其它序列均相同。,pUC,质粒含,Amp,r,，可供菌落筛选。载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的,lacZ,基因,，该基因序列中含有,多克隆位点,。,32,pUC18,载体,33,2,）噬菌体克隆载体,噬菌体,（,bacteriophage,，,phage,）,：指感染细菌的病毒。,按其生活周期分为两种类型：,溶菌性噬菌体：,指噬菌体感染细胞后，连续增殖，直到细菌裂解，释放的噬菌体又可感染其它细菌。,溶原性噬菌体：,指噬菌体感染细胞后，可将自身的,DNA,整合到细菌的染色体中，和细菌染色体一起复制。,34,野生型的,噬菌体是线性双链,DNA,，全长约,48.5Kb,，其中,60%,（约,30Kb,）是溶菌生长所必需，中间,40%,的区域为非必需，,可被外源,DNA,片段代替而不影响,噬菌体的生存。,噬菌体,5,末端含,12,核苷酸的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称为,cos,位点,，,噬菌体感染宿主菌后，其粘端通过碱基配对而结合，形成环状,DNA,分子。,噬菌体载体,35,噬菌体载体的结构,36,噬菌体载体的特点,重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体的,75%105%,之间。,筛选标记：,外源基因插入型：蓝白斑,(LacZ),筛选。,外源基因置换型：噬菌斑数目（转染率高,100 1000,倍）。,37,噬菌体载体的用途,用作一般的克隆载体。,用于构建基因组或,cDNA,文库（,22Kb,）。,用于抗体库或随机肽库的构建。,核酸的序列分析。,38,M13,噬菌体,野生型,M13,噬菌体为,6.4Kb,左右的闭环正链,DNA,分子。克隆的,外源基因片段,1kb,。,M13,噬菌体能以,单链和双链,两种方式存在，可用,于,感染(经包装的单链,DNA),和转化(双链,DNA),。,M13,中引入的多克隆位点，正好插入,LacZ,基因内，可利用,蓝白色噬菌斑,筛选重组体。,M13,噬菌体只降低宿主细胞的生长速度，而不溶解宿主细胞（,呈,溶源状态生长,，,故可从细菌培养液中获得噬菌体，制备单链,DNA,）。,39,M13,噬菌体,在细菌内的复制模式图,噬菌体,正链,复制,复制型,DNA,经,pII,蛋白,造缺口,3,5,5,3,3,5,滚环复制,释出单链,DNA,(,正链,),经,pII,蛋白,剪切,进入下,一循环,40,粘粒,(cosmid),是由质粒和,噬菌体的,cos,位点构建而成。,粘粒载体组成：,质粒复制的,起始位点,(Ori),。,携带,抗药,基因。,用于插入目的基因的,单一酶切,位点。,噬菌体的,cos,位点。,3,）粘粒克隆载体,41,粘粒载体的,特点,粘粒载体大小为,4,6Kb,，而,插入外源基因长达,40,50kb,。,加入,噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装成,类似于,噬菌体的具感染能力的颗粒,，容易进入大肠杆菌。,粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体的功能，而,表现质粒的特性。,42,粘粒载体的,用途,克隆大片段,DNA,。,构建基因组文库。,43,2,、表达载体,表达载体,是指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。,基因表达、合成有功能的蛋白质依赖于,基因的有效转录、,mRNA,正确的翻译和翻译后加工。,44,报告基因（,reporter gene,）,为了判断某一待测,DNA,序列的生物活性，常采用报告基因方法。,报告基因,：是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来,反映上游待测基因功能,的基因，又称报道基因。,45,1,）原核细胞表达载体,真核基因在原核细胞中表达需要保证外源基因：,插入方向的正确性；,受原核启动子的控制；,必须能在原核细胞中有效转录和有效翻译。,外源基因在原核细胞中表达需要重要调控元件。,46,原核细胞的表达载体主要是,大肠杆菌表达载体,。,大肠杆菌表达载体是在克隆载体的基础上导入表达系统调控元件：,启动子,核糖体结合位点,转录终止信号。,47,（,1,）启动子（,promoter,）,如乳糖启动子（,Lac,）、色氨酸启动子（,Trp,）、,Tac,启动子（,Trp-Lac,）以及,PL,和,PR,启动子等。,5,TTGACATATAAT/,3,-35,区,-10,区 转录起始点,Pribnow box,DNA,原核细胞启动子示意图,48,（,2,）,SD,序列,mRNA,49,（,3,）终止子（,terminator,）,终止子：,一个基因的,3,末端有一特定的,DNA,序列，它具有被,RNA,聚合酶识别并停止转录的功能。,该序列含有一段富含,A/T,和富含,G/C,的,回文对称结构，终止子转录后形成的,RNA,具有,茎环状局部二级结构,。,50,-,NNAA,GCGCCG,NNNN,CCGGCGC TTTTTT,NNN,-,DNA,-,NNTT,CGCGGC,NNNN,GGCCGCGAAAAAA,NNN,-,G/C,富含区,2,G/C,富含区,1,A/T,富含区,5,3,5,3,RNA,-,NN,AA,GCGCCG,NNNN,C,CGGCGC,UU,UUUU,NNN-OH,5,3,RNA,结构,5,G C,N,N N,N,C,C G,C G,C G,G C,G C,A U,A U,NNNN,UUUU-,OH,3,DNA,转录的强终止子模式图,转录,51,非融合型表达载体：产生外源蛋白，易被原核细胞蛋白酶降解。如,pKK223-3,质粒载体。,分泌型表达载体：产生带信号肽的分泌型融合蛋白，可减少外源蛋白被降解以及使蛋白质能在细胞外正确折叠，易提取。如,PINlll,系列。,融合型表达载体：产生由较短的原核细胞多肽和真核细胞蛋白质构成的融合蛋白，具有抗原性，较天然的外源蛋白稳定。如,pGEX,系列。,原核细胞表达载体的类型,52,真核表达载体的真核表达元件有：,启动子,/,增强子,终止位点和加,poly A,信号,。,原核质粒序列,：包括复制起始序列和抗药基因标记。,启动子,：转录起始位点上游,2530bp,有富含,AT,的,TATA,框，,TATA,框的上游约,100200bp,处为上游启动子元件。,增强子（,enhancer,）,：是一类显著提高基因转录效率的顺式作用元件。,终止子和加,polyA,信号（,AAUAA,）。,2,）哺乳动物细胞表达载体,53,目的基因的获取,载体的选择,目的基因和载体的连接,重组,DNA,导入受体细胞,重组体的筛选和鉴定,4.3,基因工程的基本步骤,54,连接,含,重组子,的,阳性克隆,载体,+,目的基因,转化、筛选,和,鉴定,阳性克隆,DNA,重组体,+,受体细胞,基因工程的基本步骤,分、切、接、转、筛,55,1,）从基因文库中获取,2,）逆转录合成,cDNA,3,）人工合成,DNA,片段,4,）直接从染色体,DNA,中分离目的基因,1,、目的基因的获取,56,1,）从基因文库中获取,目的基因：,指被研究的某一基因或,DNA,序列，即需要克隆或表达的基因。,基因组文库,（,genomic library,，,G-,文库）,是指含有某种生物全部基因随机片段的重组,DNA,克隆群。,57,用逆转录法得到的目的基因进行克隆，可获得,较完整的连续编码序列,，易在宿主细胞中表达及筛选。,选用富含目的基因,mRNA,的细胞作为实验材料，有利于分离到目的基因。,如胰岛素基因的,mRNA,主要存在于胰腺组织，血红蛋白基因的,mRNA,占网质红细胞总,mRNA,的,50%90%,。,2,）逆转录合成,cDNA,58,根据已知基因的核苷酸序列或基因产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸短序列，再用,DNA,合成仪人工合成目的基因。,适用于合成,分子量较小,的目的基因（,100bp,以内）。,如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、胸腺素及胰岛素原的基因等。,3,）人工合成,DNA,片段,59,根据染色体,DNA,的限制性内切酶图谱，用适当的限制性内切酶切割染色体,DNA,、分离目的基因。,适用于制备,原核生物,目的基因，因为：,真核细胞染色体,DNA,有丰富的内含子，它们在原核细胞中转录后不能被剪接。,真核细胞的基因多数为单拷贝，难以分离到足够量的目的基因。,4,）直接从染色体,DNA,中分离目的基因,60,根据外源,DNA,的特性和受体细胞的特性选择合适的载体。,2,、载体的选择,61,1),粘性末端连接,3,、目的基因和载体的连接,本法适用于在质粒和目的基因上有,相同,单或双,酶切位点。,62,粘性末端,DNA,重组体的构建,3,HO-G CTTAA-,p,5,5,p,-AATTC G-OH,3,3,HO-G,CTTAA-p 5,5,p-AATTC,G-OH 3,质粒,目的基因,目的基因和载体连接,EcoR,EcoR,碱性磷酸酶,3,HO-G CTTAA-,OH,5,5,HO,-AATTC G-OH,3,退火,DNA,连接酶,3,HO-G CTTAA,G,CTTAA-p 5,5,p,AATTC G,AATTC,G-OH 3,63,2),平末端连接,质粒和目的基因上没有相同的酶切位点,质粒,产生,平末端,的,内切酶,DNA,连接酶,目的基因,产生,粘性末端,的,内切酶,产生,粘性末端,的,内切酶,核酸酶,S1,核酸酶,S1,64,人工接头,本法适用于在,质粒和目的基,因上,没有相同,的酶切位点。,65,本法适用于在,质粒和目的基,因上,没有相同,的酶切位点。,通过同聚尾连接,66,质粒,目的基因,3,3,3,ACGTC G 5,5,G CTGCA 3,3,GnGGG,ACGTC G 5,5,G CTGCA,GGGGn,3,3,CnCCC,5,5,CCCCn 3,末端转移酶,dGTP,末端转移酶,dCTP,混合，退火,1,）转化细菌,2,）体内修复,同聚尾连接法构建,DNA,重组体,G,CCCC,GGGG,ACGTC,CTGCA,GGGG,CCCC,G,Pst,核酸外切酶,目的基因和载体连接,GACGT,C,CTGCA,G,G,ACGTC,C,TGCA,G,CCC,GGG,GGG,CCC,Pst,Pst,67,4,、重组,DNA,导入受体细胞,常用的受体细胞是,大肠杆菌,。,转化,（,transformation,）：是指,以质粒,DNA,或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。,感受态细胞,(competent cell),：,细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源,DNA,能力的细胞。,68,制备感受态细胞的基本方法,CaCl,2,处理，增加大肠杆菌细胞膜通透性。,电击法，高压脉冲使细胞膜形成暂时性微孔。,69,1,）,重组体的筛选,根据载体的抗药性标志筛选,大多数质粒载体带有,抗生素抗性基因,（如,Amp,r,、,Tet,r,等），,当带有完整抗性基因的载体转化无抗性细菌后，,被转化的阳性菌获得抗生素抗性基因而存活并形成菌落，,未转化菌不能存活，但应排除未重组的空载体。,5,、重组体的筛选和鉴定,70,根据载体抗药性标志插入失活选择,某些质粒载体如,pBR322,质粒中有,Amp,r,和,Tetr,抗性基因，在这两个基因中装有几个常用的,MCS,，如将外源,DNA,片段插入,BamH,识别序列时，则此质粒由,Tet,r,变为对四环素敏感（,Tet,s,）。,这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂糖平皿上不能生长而在含氨苄青霉素的平皿上能够生长。在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体，此筛选方法称为,双抗生素筛选法,。,71,双抗生素筛选法,72,-,半乳糖苷酶基因失活筛选（,蓝白斑筛选法,）,某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的,lacZ,基因，该基因含一段编码,-,半乳糖苷酶氨基末端,145,个氨基酸,-,肽的,DNA,片段，,IPTG,可诱导此片段合成，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型,-,半乳糖苷酶实现,基因内,-,互补,，形成完整的,-,半乳糖苷酶，催化指示剂底物,X-gal,形成蓝色产物，结果重组克隆呈蓝色菌落。,当外源基因插入,lacZ,基因中,MCS,，,lac,-,肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无,-,半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这是常用的,蓝白斑筛选法,。,73,74,根据插入的外源性基因的性状进行筛选,当细胞生物合成途径中某个酶的编码基因失活后，该细胞成为,营养缺陷型,，如导入细胞的重组,DNA,能弥补缺陷的基因，那么培养基中就不需补充有关的营养成分，由此可挑选出含重组,DNA,的阳性细菌。,75,核酸杂交技术筛选,将转化细菌平板转移至硝酸纤维素薄膜上，应用,特异性的核酸探针,对其进行原位杂交，可筛选出阳性克隆。,对于噬菌体载体的克隆，此法也可通过噬菌斑的原位杂交筛选阳性克隆。,通过斑点杂交和,Southern blot,杂交技术筛选,。,76,2,）重组体的鉴定,根据重组子大小鉴定,重组子装有外源,DNA,，分子量较原载体大得多，从挑选的菌落中分别提取重组,DNA,和原载体,DNA,，直接进行电泳，,原载体,DNA,分子量较小、电泳迁移率较大；,而,重组,DNA,因分子量较大而迁移率较小,。,77,酶切鉴定,分别提取重组载体,DNA,和原载体,DNA,，根据已知外源基因两端的酶切位点，分别用相应的内切酶进行切割，经琼脂糖凝胶电泳后，只出现一条区带的是原载体本身，而,重组载体,还多一条,外源,DNA,片段的区带,，可根据,DNA mark,来分析插入,DNA,片段的分子量。,78,PCR,鉴定,提取重组子,DNA,，利用插入外源基因两端互补的特异引物，对重组子,DNA,进行,PCR,扩增。此法不仅可分离扩增目的基因，还可对目的基因进行测序。,79,DNA,序列分析鉴定,DNA,序列分析是确定分离的,DNA,是否是特异的外源性插入,DNA,的唯一方法（,金标准,），也是最确定的方法。,自动化，快速、简便和实用。,80,8,核酸分子杂交,8.1,核酸杂交基本原理,8.2,核酸探针技术,8.3,核酸分子杂交技术,8.4,基因芯片,81,核酸定性或定量检测,基因克隆、突变及其表达研究,疾病的临床诊断,主要用途,82,8.1,核酸杂交基本原理,核酸变性,核酸复性,核酸分子杂交,83,8.1.1,核酸变性,变性,（,denaturation,）：在某些理化因素的作用下，维系,DNA,分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，,DNA,由双螺旋变成单链过程。,化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键和疏水键发生断裂，断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的。,化学结构变化：,DNA,变性改变了其空间结构，不涉及到其一级结构的改变。,84,85,DNA,的变性因素,凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件。,加热,极端的,pH,有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）,86,变性,DNA,的理化性质,溶液黏度降低：,DNA,双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软”无规则单股线性结构，,DNA,黏度明显下降。,溶液旋光性发生改变：变性后,DNA,分子的对称性及局部构型改变。,紫外吸收增加,：,DNA,变性后，,DNA,溶液的紫外吸收增强。,双链,DNA,单链,DNA,单核苷酸,87,增色效应,：,DNA,变性时其溶液,OD,260,增高的现象。,88,解链曲线,通常利用,DNA,变性后在波长,260nm,处吸光度（,A260,）的增加来监测,DNA,变性的过程。如果以温度对,A260,的关系作图，所得的曲线称为解链曲线。典型,DNA,变性曲线呈,S,型。,89,融解温度,融解温度,（,melting temperature,，,T,m,）：在热变性过程中，紫外吸收增加达到最大值的,50%,时的温度称为,DNA,的解链温度或融解温度。,爆发式,：热变性是在变性温度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到熔点时的融化现象，故名融解温度。,狭窄性,：变性温度范围很小。,90,T,m,的影响因素,DNA,分子大小和碱基的组成,溶液的离子强度,pH,值,变性剂,91,1,、,DNA,分子大小和碱基的组成,DNA,的均一性,碱基组成的均一性,样品组成的均一性,DNA,的（,G+C,）含量,92,DNA,的（,G+C,）含量,在溶剂固定的前提下，,T,m,值的高低取决于,DNA,分子中的（,G+C,）的含量。,（,G+C,）含量越高，,G-C,碱基对越多，,T,m,值越高。,核苷酸,20bp,：,T,m,=4,（,G+C,）,+2,（,A+T,）,93,94,2,、溶液的离子强度,溶液中离子与,DNA,分子中磷酸基团形成离子键，需要较高温度才能使,DNA,变性。,离子强度较低时，,T,m,值较低，而且解链的温度范围也较宽。,95,3,、,pH,值,pH,值影响氢键的形成。,pH,值在,5-9,范围内，,T,m,值变化不明显。,pH,值小于,4,或大于,11,时，均不利于氢键的形成，,DNA,容易变性。,96,4,、变性剂,干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可以降低,T,m,值。常用的变性剂有甲酰胺、尿素、,甲醛,等。,97,8.1.2,核酸复性,复性,（,renaturation,）：指变性,DNA,在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。,退火,（,annealing,）：热变性,DNA,一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。,双链,DNA,、,RNA,双链区、,DNA:RNA,杂交双链以及其它异源双链核酸分子都具有此性质。,98,核酸复性的影响因素,温度和时间,DNA,浓度,DNA,分子大小和复杂度,离子强度,99,1,、温度和时间,一般认为比,T,m,低,25,左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。,复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过,T,m,的温度下迅速冷却至低温（如,4,以下），复性几乎是不可能的。,100,2,、,DNA,浓度,DNA,复性的第一步是两个单链分子间的相互作用,“,成核,”,。,“,成核,”,速度与,DNA,浓度的平方成正比。,溶液中,DNA,分子越多，相互碰撞结合,“,成核,”,的机会越大。,101,3,、,DNA,分子大小和复杂度,用非重复碱基对（,bp,）数表示核酸分子的复杂性。,简单顺序的,DNA,分子，如多聚（,A,）和多聚（,T,）这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现。,顺序复杂的,DNA,，如小牛,DNA,的非重复部分（一般以单拷贝存在于基因组中），这种复杂的特定序列要实现互补，显然要比上述简单序列困难得多。,102,4,、离子强度对复性的影响,增加盐浓度可增加互补链合成双链的速度，盐中和,DNA,单链中磷酸基团的负电荷，减少互补链静电排斥。,103,8.1.3,核酸分子杂交,核酸分子杂交,（,molecular hybridization,）,:,两条,DNA,链或两条,RNA,链或一条,DNA,链和一条,RNA,链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。,104,杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链实现复性。,利用探针（,probe,）与靶,DNA,杂交，可识别靶,DNA,中的特异核苷酸序列。,105,5.2.2,核酸探针技术,核酸探针,（,nucleic acid probe),：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的已知被标记的核酸分子。,106,选择探针的基本原则,高度特异性,探针的来源是否方便,制备探针的难易程度,107,8.2.1,核酸探针的类型,基因组,DNA,探针,cDNA,探针,RNA,探针,寡核苷酸探针,108,来源：这类探针来源于某种生物的基因组，多为某一基因的全部或部分序列。,制备方法,:,基因克隆的方法,聚合酶链反应,(PCR),特点,:,多克隆在载体中的,DNA,片段，可无限繁殖，取之不尽。,PCR,制备探针简便和省时。,相对,RNA,而言，,DNA,探针不易降解，标记方法也较成熟。,1,、基因组,DNA,探针,109,cDNA,(complementary DNA),：是指与,mRNA,互补的,DNA,分子。,特点,:,不存在内含子和高度重复序列，是一种较理想的核酸探针，尤其是用于基因表达的研究。,排除了,RNA,酶的影响，现已成为分子生物学实验室的常规实验。,cDNA探针,110,RNA,探针与靶序列的杂交效率较高，稳定性也高。,RNA,分子大多以单链形式存在，几乎不存在互补双链的竞争结合。,RNA,分子中不存在高度重复序列，非特异性杂交少，杂交后未杂交的探针分子水解可用,RNA,酶去除，本底的干扰低。,RNA,探针有易降解和标记方法复杂等缺点，限制了其广泛应用,。,RNA探针,111,根据需要来合成相应的核酸序列，避免天然探针的缺点。,探针长度一般为,10,50bp,。,尤其适合点突变的检测。,由于探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱，但经过精心设计仍可设计出非常 特异的寡核苷酸探针。,寡核苷酸探针,112,探针长度：一般要求在,10,50,bp,。,G,C,含量为,40,60,。,探针分子中应避免互补序列。,避免同一碱基连续出现，一般不能多于,4,个，如,GGGG,-,或,-,CCCC,-,。,借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较。,探针,设计原则,113,理想的探针标记物应具有以下特点：,检测物要灵敏、特异、稳定、简便。,标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂 交特异性、稳定性和,T,m,值。,标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉。,标记物对检测方法无干扰。,8.2.2,核酸探针的标记和检测,114,常用核酸探针的标记和检测,标记分子,标记方法,检测方法,32,P dNTP,NT,、,PCR,、,RP,放射自显影或液闪计数,32,P dNTP,TL,放射自显影或液闪计数,35,S,NT,放射自显影或液闪计数,3,H,NT,放射自显影或液闪计数,Bio-11-dUTP,NT,、,PCR,、,RP,酶标亲和素或酶标抗体显色,光敏生物素,可见光照射,酶标亲和素或酶标抗体显色,生物素化补骨脂素,紫外线照射,酶标亲和素或酶标抗体显色,HRP,和,ALP,化学法或直接法,酶促底物显色,FITC,和罗丹明,合成法,荧光显微镜观察,地高辛,RP,、,NT,酶标抗体,+,底物显色,115,8.3,核酸分子杂交技术,5.2.3.1,固相核酸分子杂交,5.2.3.2,原位核酸分子杂交,5.2.3.3,液相核酸分子杂交,5.2.3.4,核酸分子杂交实验条件的优化,116,分子杂交技术一般流程,探针制备及标记（同位素或非同位素）,待测核酸样品制备（分离，纯化）,杂交（液相，固相，原位杂交）,杂交后处理（去掉非特异杂交分子）,显示结果（显色，发光，放射自显影）,结果分析,117,核酸分子杂交技术类型,杂交类型,检测对象,Southern,印迹杂交,检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的,DNA,分子,Northern,印迹杂交,检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的,RNA,分子,菌落杂交,检测固定在膜上，经裂解从细菌体释放的,DNA,分子,正向斑点杂交,检测固定在膜上的,DNA,或,RNA,分子,反向斑点杂交,检测样品中的,DNA,或,RNA,分子,微板杂交,检测固定微板孔上的,DNA,或,RNA,分子,原位杂交,检测细胞或组织上的,DNA,或,RNA,分子,118,固相分子杂交：,是将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，然后放入含有标记探针的杂交液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固体杂交。,固体杂交的优点：,未杂交的游离探针通过漂洗可容易除去，膜上的杂交分子容易检测，还能防止靶,DNA,的自我复性，所以被广泛应用。,8.3.1,固相核酸分子杂交,119,DNA,变性 中和,Southern,印迹 预杂交 杂交 洗膜 检测,1,、,Southern,印迹杂交（,Southern blot,）,120,毛细管转移示意图,121,电转移示意图,122,Northern,印迹杂交是应用,DNA,探针检测特异,mRNA,的一种膜上印迹技术。,是由,Alwine,于,1977,年建立，后经,Thomas,等人改进。,用于分析,mRNA,分子大小及,mRNA,的转录情况。,2,、,Northern,印迹杂交,（,Northern blot,）,123,Northern,印迹杂交流程图,124,与,Southern,印迹杂交的不同点,RNA,提取过程中需特别注意,RNA,酶,的污染。,所用器材最好与,Southern,印迹实验分开使用。,RNA,变性的方法：不能用碱变性，因为碱会水解,RNA,的,2-,羟基基团，在,变性剂,的存在下进行电泳，防止,RNA,分子形成发夹式的二级结构，以保持其单链线形状态。,印迹前将含变性剂的凝胶用水冲洗掉，再印迹、杂交。,如果测定,RNA,片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照像，样品胶则进行,Northern,转印。,125,斑点杂交,是将待检样品（,DNA,、,RNA,或细胞）直接点到膜上，烘烤固定。,3,、斑点杂交（,Dot-blot,）,126,斑点杂交不需电泳和转膜过程，整个操作过程简便、快速。,但结果无法判断核酸片段的大小，也无法判断样品溶液中是否存在着不同的靶序列。,多用作核酸定性或半定量分析，而且便于杂交条件的摸索。,127,菌落杂交示意图,4,、菌落杂交,128,微板酶联夹心杂交动画流程,NOS,基团,捕获探针,PCR,产物,检测探针,亲和素,-HRP,四甲基联苯氨,氨基,生物素,5,、微板酶联杂交,129,捕获探针共价结合在微孔板上，不仅结合牢固而且结合量大，因而捕获能力很强。,捕获探针竖直地而不是平躺地“包被”在微孔板表面，因而与目的片段的杂交效率很高。,检测探针,5,端、,3,端均标记生物素，等量检测探针结合亲合素,-,辣根过氧化物酶的量增加。,微板酶联杂交的优点,130,8.3.2,原位核酸分子杂交,原位杂交,（,In situ hybridization,）是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法。,它属于固相分子杂交的范畴，但有别于其它任何固相核酸分子杂交技术。,原位杂交技术除了具有核酸分子杂交的特异性高的特点之外，并可,精确定位,，因此该技术已广泛地应用于分子生物学的研究之中。,131,正常或异常染色体的基因定位。,应用核酸探针与细胞内,RNA,进行杂交用于检测该组织细胞中特定基因表达水平。,应用特异的病原体核酸作为探针对组织、细胞进行杂交，以检测有无该病原体的感