泛素特异性蛋白酶USP研究进展课件.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2014/3/21,#,泛素特异性,蛋白酶,46,（,ubiquitin-specific,protease 46,USP46,）研究进展,一,.,真核细胞内蛋白质的降解途径介绍,溶酶体途径,-,非特异性的蛋白质降解,系,统，真核细胞内,90%,以上的长寿蛋白和一部分短寿命蛋白都是,在,溶酶体中降解的。,泛,素,-,蛋白酶 体途径,-,是真核细胞中具高效和,高度,选择性的特异性降解蛋白质,的重要,途径，广泛参与机体多种代谢活动。,胱天,蛋白酶,(caspase),途径,-,蛋白酶以酶原的形式存在于正常细胞中，细胞凋亡启动后被激活。,泛素,-,蛋白酶,体,系统,由,泛素、泛素化酶（,包括 泛,素活化,酶,E1,、,泛素偶联,酶,E2,、,泛素,连接酶,E3,）,、蛋白酶体和去泛素化酶组成,。,泛素化酶为底物蛋白加上泛素标签，泛素化的蛋白质被运送到蛋白酶体降解。,蛋白质的泛素化是一个可逆的过程，去泛素化酶通过对底物蛋白的去泛素化来调控蛋白质的寿命。,二,.,蛋白质泛素化与去泛素化介绍,泛,素是一个含,76,个氨基酸在结构和序列上都高度保守的蛋白质,分子，分子量,大概,8.5kDa,。,蛋白质,的泛素化修饰是一种广泛存在且非常重要的蛋白质,翻译后修饰。,调控,许多生物学功能包括,细胞周期、细胞凋亡、,DNA,损伤,修复、细胞免疫,以及,神经元,退化等方面都发挥着重要,作用。,1.,蛋白质的泛素化修饰,是,一,个泛,素分子,(ubiquitin),通过,其羧基,端结合到目的蛋白赖氨酸,(Lys,K),上的共价,反应过程。泛,素本身有,7,个赖氨酸残基,位点,，,分别,是,K6,、,K11,、,K27,、,K29,、,K33,、,K48,以及,K63,位，并且,泛素本身的赖氨酸残基也,可以再与泛,素分子相互,结合。,二,.,蛋白质泛素化与去泛素化介绍,1.,蛋白质的泛素化修饰,首先,在,E1,催化,下泛素,的羧基,端与,E1,的半胱氨酸,激活位点,以硫酯键结合,此过程需要,ATP,;,其次,泛素,被转运到,E2,的,半胱,氨酸残基,同样,是,以,硫酯键,的,形式接合,;,最后,在,E3,的作用,下,泛素,的,羧基端,与,底物蛋白的,赖氨酸,-,氨基,基团之间,形成肽键从而,将泛素转移到底物蛋白,上。,E3,具底物特异性,二,.,蛋白质泛素化与去泛素化介绍,1.,蛋白质的泛素化,修饰,步骤,www.biochemsoctrans.org/bst/032/0724/bst0320724f01.htm?resolution=HIGH,二,.,蛋白质泛素化与去泛素化介绍,2.,蛋白质,的,去,泛,素化修饰,（,1,）,亲核体如谷胱甘肽上,泛素,解离,（,2,）泛,素,加,合到细胞内其他蛋白,上,（,3,）降解,蛋白泛素,寡聚体循环利用,（,4,）,未,锚定泛素寡聚体的,解离,Alexander Y,et al.Biochimica,et Biophysica Acta,2004,(,1695,),189 207,3.,去泛,素,化酶,USP,蛋白家族介绍,二,.,蛋白质泛素化与去泛素化介绍,含有,两个短的高度保守的序列，称为,Cys,结构域和,His,结构,域,序列,中具有起催化作用的三联残基，即,半胱氨酸,、组氨酸、天冬氨酸,/,天冬酰胺，能将泛素分子从大的蛋白上移,除。,V.Quesada et al.Biochemical and Biophysical Research Communications,2004,314:5462,Multi-tissue,expression of Usp46 mRNA in,Rattus norvegicus,3.,泛素特异性蛋白酶,USP46,介绍,二,.,蛋白质泛素化与去泛素化介绍,Wei,Zhang,，,et al.PLoS ONE,2011,6(10),e26297.,USP46,调控抑郁,usp46,为 悬 尾 试 验（,Tail Suspension,Test,，,TST,）和强迫游泳试验（,Forced Swimming Test,，,FST,）中,调节小鼠不动行为的数量性状基因。,CS,和,B6.CSNgu1053,鼠在,TST,和,FST,实验中不动时间明显更短,Shigeru Tomida,et al.nature genetics,2009,41(6):688-695.,Shigeru Tomida,et al.nature genetics,2009,41(6):688-695,.,USP46,调控抑郁,CS,小,鼠,Usp46,第,92,号,赖氨酸,缺失是造成小鼠不动时间短于,C57BL/6J,小鼠的主要原因,CS,鼠,5,号染色体,上,Usp46,基因有编码一个赖氨酸的,3,个碱基缺失,Shigeru Tomida,et al.nature genetics,2009,41(6):688-695.,USP46,调控抑郁,细菌人工染色体,Usp46,转基因鼠可以逆转,CS,鼠的抗抑郁状态,Usp46,第,92,号赖氨酸,缺失导致酶活下调,Wei,Zhang,et al.PLoS ONE,2011,6(10),e26297.,USP46,基因标签,SNP,的单,倍型,与,重度抑郁症,相关,Fukuo Y,et al.Journal,of affective disorders,2011,133(1-2,):150-157.,The deubiquitination enzyme USP46 functions as a tumor suppressor by controlling PHLPP-dependent attenuation of Akt signaling in colon,cancer,去泛素化酶,USP46,通过控制,PHLPP,依赖性的,Akt,信号通路而抑制结肠,癌症,读书报告：,Xin Li,et al.Oncogene,.2013 January 24;32(4):471478.,报告人：林万华,时 间：,2013,年,11,月,16,日,三,.,去泛素化酶,USP46,通过控制,PHLPP,依赖性的,Akt,信号通路而抑制结肠癌症,1.,细胞,内,PHLPP,与,USP46,特异性相互作用,HA-PHLPP1,分别与,USP46,、,USP7,、,USP16,共转染,293T,细胞，,USP,蛋白带有,Flag,和,HA,标签，,anti-Flag,琼脂糖免疫共沉淀。,(Flag,抗体拉,USP,USP,拉,PHLPP1,，结果只有,USP46,拉下了,PHLPP1,，而,USP7,和,USP16,没有拉下,PHLPP1,，说明只有,USP46,与,PHLPP1,作用,),。同样，只有,USP46,与,PHLPP2,相互作用,。,在,DLD1,细胞中，内源性的,USP46,可与内源性的,PHLPP1,、,2,相互作用,。,293T,细胞中，,GST,GST-PHLPP1,，,GST-PHLPP2,片段拉,USP46,，只有,PHLPP,蛋白的,C,端与,USP46,相互作用。,三,.,去泛素化酶,USP46,通过控制,PHLPP,依赖性的,Akt,信号通路而抑制结肠癌症,1.,细胞,内,PHLPP,与,USP46,特异性相互作用,D.USP46,与,PHLPP,相互作用的最小作用区段是,C,端的,1139-1172,，,PHLPP1,与,PHLPP2,的,1139-1172,区段是,保守的,E.,同样,，在,PHLPP2,中，也是这个保守区段,1268-1301,与,USP46,相互作用。,三,.,去泛素化酶,USP46,通过控制,PHLPP,依赖性的,Akt,信号通路而抑制结肠癌症,1.,细胞,内,PHLPP,与,USP46,特异性相互作用,Fig,.,2A and 2B,：,在,HCT116,细胞中，超表达,WT USP46,可以显著提高,PHLPP,的蛋白水平，其效应是减少了,70%,的,Akt,磷酸化,水平。,将,USP46,催化区段,Cys,突变为,Ser,后，突变体,USP46,则失去了调控,PHLPP,表达水平和,Akt,磷酸化水平,能力。,三,.,去泛素化酶,USP46,通过控制,PHLPP,依赖性的,Akt,信号通路而抑制结肠癌症,2.,USP46,调控,PHLPP,的表达水平,在,HCT116,细胞中,，,野生型,USP46,可以上调,PHLPP1,的表达水平，而,1139,突变体和,USP46-C44S,没有效应,(Fig.2C,),失去了磷酸化位点的,PHLPP1-4A,突变体，由于有抗泛素化降解作用而使其蛋白水平远远高于,WT,PHLPP1,。,USP46,不能进一步提高,PHLPP1-4A,突变体的表达水平，表明,USP46,通过去泛素化来提高,PHLPP,蛋白的表达,三,.,去泛素化酶,USP46,通过控制,PHLPP,依赖性的,Akt,信号通路而抑制结肠癌症,2.,USP46,调控,PHLPP,的表达水平,USP46,敲低后，,PHLPP,降解大大,加快。,PHLPP1,和,PHLPP2,的半衰期分别由,4.6h,降为,2.3h,，和,6.1h,降为,3.3h(Fig.2F and 2G),。,三,.,去泛素化酶,USP46,通过控制,PHLPP,依赖性的,Akt,信号通路而抑制结肠癌症,2.,USP46,调控,PHLPP,的表达水平,体外检测,，,经,WT USP46,处理后，,PHLPP1,的泛素化水平下降，但,USP46-C44S,突变体无此效应,(Fig.3A,),经,MG-132(,蛋白酶抑制剂,),处理后提取蛋白样品检测，发现超表达,WT USP46,显著下调,PHLPP1,的泛素化水平，而,USP46-C44S,突变体无此效应,(Figure 3B),。,三,.,去泛素化酶,USP46,通过控制,PHLPP,依赖性的,Akt,信号通路而抑制结肠癌症,3.,USP46,直接,调控,PHLPP1,的,泛素化,USP46,敲低后,PHLPP1,的泛素化水平显著上升,(Fig.,3C,，,3D),。,三,.,去泛素化酶,USP46,通过控制,PHLPP,依赖性的,Akt,信号通路而抑制结肠癌症,3.,USP46,直接,调控,PHLPP1,的,泛素化,当仅超表达,PHLPP1,时，,Akt,的去磷酸化水随,PHLPP1,的表达增加而下调。然而，,Akt,的去磷酸化程度很低,(Fig.4A,lanes 1-4),。,共表达,USP46,和,PHLPP1,可以很显著地下调,PHLPP1,作用的,Akt,去磷酸化，因为,USP46,可以稳定,PHLPP1,蛋白水平,(Fig.4A,lanes 5-6),。,三,.,去泛素化酶,USP46,通过控制,PHLPP,依赖性的,Akt,信号通路而抑制结肠癌症,4.,USP46,可以增强,PHLPP,的,Akt,去磷酸化,能力,在测定,PHLPP1,和,USP46,基因对,HCT116,细胞增殖的影响时，我们发现,Akt,的磷酸化水平与细胞增殖速率密切相关,(Fig.4B),。,超,表达,PHLPP1,可以剂量性的抑制细胞增殖，,USP46,共表达则可以增强这个效应,(Fig.4B),。,三,.,去泛素化酶,USP46,通过控制,PHLPP,依赖性的,Akt,信号通路而抑制结肠癌症,4.,USP46,可以增强,PHLPP,的,Akt,去磷酸化,能力,抑制细胞增殖,敲低,USP46,可以提高,Akt,的磷酸化水平，敲低,USP46,后,WT PHLPP1,的,Akt,去磷酸化能力大大下降，而抗泛素化的,PHLPP1-4A,的,Akt,去磷酸化能力不变,(Fig.4C),。在敲低,USP46,的细胞内，,PHLPP1,很难抑制细胞增殖,(Fig.4D),。,三,.,去泛素化酶,USP46,通过控制,PHLPP,依赖性的,Akt,信号通路而抑制结肠癌症,4.,USP46,可以增强,PHLPP,的,Akt,去磷酸化,能力,抑制细胞增殖,构建,载体,、,USP46,、,PHLPP1,、及共表达,PHLPP1,和,USP46 4,种,HCT116,细胞稳定株。将细胞株注射入裸鼠皮下，观察其后,32,天的成瘤性,。,如图,A,所示，参照组细胞能有效的成瘤，到实验结束时瘤体积达到,1600mm,3,，超表达,USP46,后瘤体积明显减小，但差异不显著。而超表达,PHLPP1,则显著减小瘤体积。共表达,USP46,则可显著提高,PHLPP1,的抑瘤能力。可从分离的瘤内检测到,PHLPP1,和,USP46,的表达。在超表达,USP46,的细胞中,PHLPP1,的表达增加，而,Akt,磷酸化水平下降,(Fig.5B),。,三,.,去泛素化酶,USP46,通过控制,PHLPP,依赖性的,Akt,信号通路而抑制结肠癌症,5.,USP46,增强,PHLPP1,肿瘤抑制能力,以,Ki67,免疫染色了肿瘤组织，发现超表达,USP46,PHLPP1,或,USP46 plus PHLPP1,的,Ki-67,阳性细胞大大减少，共表达,USP46,和,PHLPP1,的抑制效果最为明显,(Fig.5C,，,Fig.5D),。,三,.,去泛素化酶,USP46,通过控制,PHLPP,依赖性的,Akt,信号通路而抑制结肠癌症,5.,USP46,增强,PHLPP1,肿瘤抑制能力,PHLPP1,和,USP46,在,11,种结肠癌细胞系中的表达情况，结果表明，二者相关性非常显著（,P=0.002,Spearmans rank correlation,）,(Fig,.,6A,6B,),。,三,.,去泛素化酶,USP46,通过控制,PHLPP,依赖性的,Akt,信号通路而抑制结肠癌症,6.,人结肠癌,USP46,和,PHLPP1,的表达情况,免疫组化法检测了结肠癌组织样品和正常黏膜组织内,PHLPP1,和,USP46,的表达情况,，,PHLPP1,的表达在正常结肠上皮组织的粘膜上大量表达,(Fig.6C and 6D),。,同样,，,USP46,在正常组织的细胞质和细胞膜均有表达,(Fig.6E and 6F),。,但,在结肠癌组织中,PHLPP1 or USP46,的表达缺失,(Fig.6G-6J),。,三,.,去泛素化酶,USP46,通过控制,PHLPP,依赖性的,Akt,信号通路而抑制结肠癌症,6.,人结肠癌,USP46,和,PHLPP1,的表达情况,谢谢！,