DNA提取实验报告.doc

生物学大实验(二)
实验名称:质粒扩增、提取与鉴定实验
实验目得 通过对智力扩增、提取与鉴定试验得实验原理介绍与实际操作,加深对分子生物学基本技术得理解与掌握。
实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等.
实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌与真菌细胞中,通过对细菌、放线菌与真菌得培养来实现对质粒得扩增。经过处理得线状dna在外界环境恢复正常得时候不能够复性 而质粒dｎa可以复性,从而可以实现质粒ｄｎa与染色体dｎa得分离。限制性内切酶能特意地结合于一端被称为限制性酶识别系列得dna系列之内或其附近得特异位点上,并切割ｄna。当对提取得质粒dnａ进行电泳时，同一质粒dna其超螺旋形式得泳动速度要比开环与线状分子得泳动速度快。
实验步骤：
一　质粒扩增
(1)普通lb固体培养基制备:
制备ｌb培养基，倒入灭菌瓶中高压灭菌,待完全冷却后,保存备用。
(2)将大肠杆菌接种于lb培养基中,37℃振荡培养过夜(２00转/分)
二 质粒dna得提取(碱法)
１将菌液倒入1、5ml得微量离心管中,　120００rｐm离心一分30秒,弃去上清液,以得到较多得细菌沉淀；
2、 将微量离心管开口倒置在卫生纸上,使离心管底部得液体流尽。
3、 加入10０μl用冰预冷得溶液ｉ，剧烈振荡,将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟．
4、　加入200μｌ现配得溶液iｉ,盖紧管口,轻轻快速颠倒离心管(不要振荡,以避免dna断裂),使混合物混匀,冰浴５～10分钟。
5、 加入150μl预冷得溶液iii，盖紧管口，温与颠倒混匀,使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液ｉｉi中，冰浴５分钟。
6、　取上部水相,移入新得离心管,加入2倍体积预冷得无水乙醇(也可同时加入1/10倍体积得醋酸钠),震荡混匀,室温放置10分钟沉淀双链dna，然后4℃,120００ｒpｍ离心10ｍin。
7、 弃去上清液,将离心管倒置于卫生纸上,使离心管底部得液体流尽后,加　入预冷得１ml 70％乙醇。
8、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上,使液体流尽，置dna干燥5～1０分钟。
９、吸除上清液,将管口倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥.
10 、　　将沉淀溶于３4υｌte缓冲液或灭菌水（ph8、0）中，储于-２0℃冰箱中
三ｄnａ酶切反应
1、 将洁净干燥并经灭菌得epｐendｏrf 管(最好0、5ｍl）编号,用微量移液枪分别加入dnａ（υl)与相应得限制性内切酶反应１0×缓冲液２υｌ,将管内溶液混匀后加入０、５υl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可以用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作就是整个实验成败得关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱得时间,以免活性降低。
2、 混匀反应体系后,将eppeｎdorf管置于适当得支持物上（如插在泡沫塑料板上），3７℃水浴锅保温２—3小时，使酶切反应完全。
3、 每管加入2υl０、１mol/l edtａ（ｐh8、0），混匀，以停止反应，置于冰箱之保存备用。
四 dna得琼脂糖凝胶电泳
1、 取5×tbe缓冲液１００ml加蒸馏水至1００0ｍl,配成0、5×tbe稀释缓冲液,待用。
２、 　胶液得制备:称取3ｇ琼脂糖置于10０0mｌ锥形瓶中，加入30０ml　0、5×tbe稀释缓冲液，加入微波炉里加热至琼脂糖全部融化,取出摇匀,此为１％琼脂糖凝胶液．加热过程中要不时摇动,使其附于瓶盖上得琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水分蒸发。
3、　 胶版得制备:想冷却至５0—60℃得琼脂糖胶液中加入溴化乙锭（eｂ）溶液使其终浓度为0、5υｌｇ/ml。倒胶时得温度不可太低,否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则溶液出现气泡,待胶完全凝固后，拔出梳子注意不要损伤梳底部得凝胶,然后向槽内加入０、５υ×tbｅ稀释缓冲液至页面恰好没过胶板上表面
4、　　加样:取20υl得酶解液与2υｌ10×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中，每加完一个样品要更换tiｐ头以防止互相污染,注意上样时要小心操做，避免损坏凝胶或将样品槽底部得凝胶刺穿
5、 电泳:加完样后合上电泳槽盖，立即接通电源,控制电压保持在60—80v,电流在40ｍa以上,当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿2cm时停止电泳
6、　 观察与拍照
五 实验结果
六 实验结论
通过本次试验加深了对分子生物学以及基因工程得深入了解,右上第三第四根亮柱就是我得结果。结果显示，第三条中酶切效果良好，ｒnａ被降解得很完全,第四根没有被酶切，质粒dnａ跟rna同时存在，出现了两条亮带，质粒dnａ跟rｎa分离效果较好．
本实验需要细致认真得完成,所以特别在凝胶电泳中要十分注意以下事项:
(1)　取出梳子之前,一定要耐心等待琼脂糖凝胶得凝固，拔梳子就是一定要手稳,而且要
垂直拔出;
（２) 点样要细心，枪头不要碰到凝胶,以免点样枪刺破凝胶;
(3) 电泳时,电极一定要连接正确
(４) 染色剂溴化乙锭就是强诱变剂,有致癌性与强毒性，使用时一定要带一次性手套,使
用后废液不可不可随意丢弃。
生物科学　071班　 姓名:刘欢 学号:２0073305篇二:ｄna得提取与电泳实验报告
基因组ｄｎa得提取与电泳（实验五）实验报告
一、实验目得
了解dnａ提取得方法,以及琼脂糖凝胶电泳分析dna技术。
二、器材与试剂
1. 器材
水平琼脂糖电泳仪,离心机,水浴锅,研钵，离心管、移液枪、水稻幼苗等
2. 试剂
1. 1mol/l tｒｉs、cl(ｐh8、0) 得配制：称取１2、1１g 得tｒis,置于80 ｍl得ddh20,加入浓盐酸
(约4、2 ｍｌ),调节pｈ值至８、0,定容至10０ mｌ.
2. 0、5 ｍｏl/l edtａ(ph8、０）得配制:1８、6１g na2edｔa·2h2ｏ,加入80　ml得ddh2ｏ,用naoh颗粒调ｐh值至８、0(约需２ g),定容至1０0 mｌ。
3. 提取缓冲液得配制: 100 mmol/l ｔris、cｌ(ｐh8、0）， 20 mｍｏl/ledｔa，　500　mmol/l ｎaｃｌ，
1. ５％sds
４、 80/４/１6氯仿：异戊醇:乙醇
5、　　6?loading　buffer:０、1５％溴酚蓝，0、１5%二甲苯青ff,5　mｍol/ｌ edta,50%甘油
三、实验步骤
1. 在15ｍl得离心管中加入５ｍｌ得提取缓冲液,60℃水浴预热。
2. 植物叶1-２g,剪碎,在钵体中加入石英砂,加入预热得提取缓冲液,磨成粉末状，
6０℃水浴保温20 min，其间不时缓慢摇动.
3. 50００ rpm离心5分钟，仔细吸取上清液至另一离心管中，
4. 加入５　ml 氯仿/戊醇／乙醇溶液,颠倒混匀（需带手套,防止皮肤损伤),室温下静置
５—10分钟，使水相与有机相混匀。
5. 室温下离心5000 rpｍ离心5分钟。
6. 仔细吸取上清液至另一离心管中,加入一倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出
现絮状沉淀。
7. 离心５0０0 rpm,离心5　min,弃去异丙醇，室温晾干。
8. 视沉淀多少,加入1ml左右ｄdh2ｏ溶解，可在60℃水浴中放置1５分钟以上助溶.
9. 取ｄna样品5　μl,加入1 μl６?loａdｉng bufｆｅr,混匀,加入０、7%得琼脂糖凝胶加样孔
中,电泳,检测dna得分子大小。
4、实验结果与讨论
实验分析:本次实验由于种种原因我就是与植保102班得同学一起做得，我们组３人,实验过程比较严谨,受到了老师得表扬,实验结果也很令人满意。
下面就是实验过程中得注意点:１、研磨不能太久太用力,会导致dnａ片段断掉。２、实验室得某些试剂,如氯仿,有毒性,应带手套进行。
电泳得时候不知就是时间得原因还就是都做得不错,结果相差不就是很远（如上图)，第五组与第六组就是我们得，第六组就是我自己加得.实验过程中要耐心细心，这样才能得到满意得结果。
园艺10１
石颖
20１001０７011篇三:浙大生化实验报告ｄna得提取
实验报告
课程名称: 生化实验甲 指导老师: 　 　 成绩:__________________ 实验名称：植物基因组ｄna得提取 实验类型: 生化定性实验 同组学生姓名:　 及纯度与含量得测定　 一、实验目得与要求(必填) 　二、实验内容与原理（必填) 三、实验材料与试剂（必填) 　　 　　 　 四、实验器材与仪器（必填) 五、操作方法与实验步骤（必填） 　 　　 　六、实验数据记录与处理 　七、实验结果与分析（必填） 　　 八、讨论、心得 一、实验目得与要求 1、学习并掌握植物基因组dｎa得提取原理与方法； ２、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸得原理与操作; ３、学习并掌握对电泳检测基因组dnａ结果得初步分析； ４、学习紫外吸收法测定核酸基本原理与方法;　5、学习并掌握紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量得方法。　二、实验基本原理 植物基因组dna得提取方法就其提取原理主要有二种：十六烷基三乙基溴化铵(ctaｂ）法、十二烷基硫酸钠 (ｓds)法。十六烷基三甲基溴化铵与十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜与
核膜蛋白，使核蛋白解聚,从而使ｄna得以游离出来。再加入苯酚与氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性,并使抽提液分相，因核酸(dna、rna)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片与大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使dnａ沉淀,沉淀dｎa溶于ｔe溶液中，即得植物基因组 dna溶液。
由于植物中得次生代谢产物——多酚类化合物可介导dnａ降解,而多糖得污染也就是影响植物核酸纯度最常见得问题,这些多糖能抑制限制酶、连接酶及dna聚合酶等分子生物学酶类得生物活性。传统得cｔaｂ-dｎa提取法步骤多，较烦琐，ｄna产率低，而且由于酚很难完全去除,容易影响以后得酶切等工作得效率。sdｓ法操作简单，温与,也可提取到较高分子量dnａ,但所得产物含糖类杂质较多,这将直接影响dｎa得限制性核酸内切酶酶切效果。由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其就是氧化酶类）对dna得抽提产生不利得影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类得活性。
本实验采用十二烷基硫酸钠 （sds)法提取植物基因组dna，基因组dna提取后, ①通过琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组dnａ分子量大小、纯度;②用紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量．
ｄna得琼脂糖凝胶电泳鉴定:
ｄｎａ分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应与分子筛效应。ｄna分子在高于等电点得溶液中带负电荷,它在电场中向正极移动.在一定得电场强度下,dna分子得迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同得相对分子量得dna片段泳动速度不同。dｎa片断在凝胶中当用低浓度得荧光嵌入染料溴化乙锭(eｂ)染色后,在紫外光下可见橙红色带,并可确定dna片断在凝胶中得位置.
紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量
核酸－—dna与rｎa所含碱基得苯环结构(嘌呤环与嘧啶环)得共轭双键具有紫外吸收得性质，它们在260nm处有最大得吸收峰。因此,可以用26０nm波长进行核酸含量得测定。
波长为260ｎm时，ｄna或ｒnａ得光密度得大小不仅与总含量有关，也与它们得不同构型而有差异。
对标准样品来说,浓度为1μｇ /　mｌ时，dna钠盐得ｏd２60=０、02。
当od260＝1时,双链dna含量约为5０μg　/　mｌ
单链dna含量约为37μg / ml
rna含量约为４0μg /　mｌ
寡核苷酸含量约为３０μg ／ ml(由于底物不同有差异)
1、核酸样品dna、rna含量得测定：
如用1ｃm光径石英比色皿，用 h2ｏ稀释dｎa或rna样品n倍并以h2ｏ为空白对照,根据此时读出得od260值即可计算出样品稀释前ｄｎa得含量:
ｄnａ(μg/μｌ)=5０×oｄ2６0读数×　ｄna样品稀释倍数/1000
rna(μg／μl)=4０×ｏｄ２6０读数× ｒna样品稀释倍数/100０
若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量,可使用溴化乙锭法或其她方法进行估算。
当dｎａ样品中含有蛋白质、酚或其她小分子污染物时,会影响dｎa吸光度得准确测定。由于 dｎa在2６0nｍ处有最大得吸收峰,蛋白质在280ｎm处有最大得吸收峰,盐与小分子则集中在230nm处。所以，一般情况下同时检测同一样品得ｏd260、oｄ280与oｄ230,计算它们得比值来判断核酸样品得纯度.
2、核酸样品纯度判断得一般标准:
⑴ dｎa纯度:oｄ２6０/od２８0≈１、8,表示为纯得ｄna；
oｄ2６0／ｏｄ２8０ ＞１、9，表示有rna污染；
od260/ｏｄ280 <1、6,表示有蛋白质、酚等污染。
⑵　rnａ纯度：1、7　＜ｏd2６０/od280<２、0,表示为纯得rna；
oｄ260／od280　＜1、７时,表示有蛋白质或酚污染；
od260/od2８0　>2、0时，表示可能有异硫氰酸残存。
⑶ oｄ２30/ｏd26０得比值应在0、４－0、5之间，若比值较高说明有残余得盐与小分子如核苷酸、氨基酸、酚等得存在。
若样品不纯,则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量；同时也会影响酶切与ｐcr得效果。
三、实验材料与试剂
1、实验材料:植物幼嫩叶子
2、实验试剂
(１）基因组dna提取缓冲液
（2)氯仿:异戊醇:乙醇抽提液
(3）te缓冲液
(4)平衡酚:
(５）rｎa酶a
(6)酚／氯仿
(7)氯仿/异戊醇
(8）异丙醇、无水乙醇、7０%乙醇。
(9) 3mol/l naac
（１０) 5×tｂe缓冲液
(１1) 6×电泳上样缓冲液
（１２)　１、０%琼脂糖凝胶
（13)　eb
(14） dnａ分子量markers:12５,56４,2０27，232２,４361,65５７,9416,231３0bp、
(15） ddh２o；
四、实验器材与仪器
1、研体
2、离心机、离心管(7ml、5ｍl)及离心管架;
3、微量移液器10ｕl、200ul、1００0ul及枪头；
４、恒温水浴箱65 ℃
5、制冰机;
６、冰箱;
7、恒温水浴箱 37℃;
8、微波炉；
９、电泳仪及电泳槽;
10、紫外检测仪。
11、紫外分光光度计；
１2、石英比色皿（０、5ｃm光径）或1cm光径得微量石英比色皿（5０ｕl、1００ｕｌ).
(二）琼脂糖凝胶电泳检测基因组ｄｎa
1、制胶(１％琼脂糖凝胶)（此步骤由实验室老师准备）
在胶模上架好梳子。称取01g琼脂糖,置于２5０ml锥形瓶中，加１00ｍl 0、５×tbe电泳缓冲液,加热熔化至无颗粒状琼脂糖，待其冷却至50~６0℃后,加入ｅb,使其终浓度为0、５mｇ／l,摇匀后立即倒入准备好得胶模中,待胶凝固后，放入电泳槽中，倒入适量0、5×ｔbｅ(刚好淹过胶面),拔去梳子备用。(注:eb为诱变剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作)
２、加样
取５uｌ纯化得dna原溶液样品,与1ｕl 6×电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中(注：勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡)。若dｎa含量偏低，则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量．每加完一个样品要换枪头以防互相污染。注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
3、电泳
加完样后，盖上电泳槽盖,立即接通电源,使电压调到１00ｖ,恒压电泳。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约２cm时，停止电泳(约需30~６0min）。
4、观察与拍照
取出胶块置于紫外灯下观察，ｄna存在处可显示出肉眼可辨得橘红色荧光带,再用成像仪进行拍照,以便于分析.(注:紫外光对眼睛有害,观察时戴上防护镜或眼镜,或隔着玻璃或有机玻璃观察）。 紫外吸收法测定基因组ｄna纯度与含量
将提取得植物基因组ｄna样品吸取2０ul,加到新得5mｌ离心管中，再加一定量得ddｈ2o　或tｅ缓冲液(ph ８、0)稀释100倍,用0、５ｃm光径石英比色皿（约需1、6ml样品溶液）或微量石英比色皿在紫外分光光度计上测定230nｍ、260ｎｍ、２80nm处得吸光度。计算植物基因组dna样品溶液得dna得含量以及dna样品得纯度。
六、结果与分析
(一）
这就是电泳后得到得照片,其中从右往左数第七条带为我所做样品得基因组.
(二）紫外吸收法测定基因组dnａ纯度与含量
1、植物基因组dｎa样品溶液得dｎa得含量:
dna(μg/μl )=9５９、3２8ng／ul
2、植物基因组ｄｎa样品溶液得dna得纯度:
oｄ260/od２80=1、９7
od230/od2６0＝2、０７
３、样品纯度判断:
⑴ od26０/od280 ≈１、８,表示为纯得dna；
⑵ ｏd260/od２8０ ＞１、９,表示有ｒna污染；
⑶　 ｏd２60/od28０ <1、６,表示有蛋白质、酚等污染。
由od2６０/od2８0=１、9７可知,样品含有rna杂质。
七、讨论、心得
注意事项:影响ｄna泳动速率(迁移率)得因素有:
⑴ dna分子质量得影响：双链dｎａ分子迁移得速率与ｄnａ分子量对数成反比。分　 　 子量越大,迁移率越小。
⑵ dna构型得影响:超螺旋dna＞线状dnａ>开环dna
⑶ 胶浓度得影响: 浓度越低,相同核酸分子迁移越快,一般常用得凝胶浓度为１％～2%;
⑷ 电场强度得影响:电场强度愈大，带点颗粒得泳动越快.但凝胶得有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压,（一般5v/cm）(电场强度） 。而对于大片段电泳,甚至用0、5~１、0v/cm电泳过夜。进行高压电泳时,只能使用聚丙烯酰胺凝胶。
⑸ ｅb得影响:溴化乙锭（eb)插入双链ｄｎａ造成其负电荷减少、刚性与长度增加。
⑹ 电泳缓冲液得影响:核酸电泳常采用tae、tbe、tpｅ三种缓冲系统,但它们各有利弊。ｔａe价格低廉,但缓冲能力低,必须进行两极缓冲液得循环。tpe在进行ｄna回收时,会使ｄna污染磷酸盐,影响后续反应．所以多采用ｔbｅ缓冲液.在缓冲液中加入eｄta,可以鳌合二价离子,抑制dnase，保护ｄｎa。缓冲液ph常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电,向正极移动。
⑺ 碱基组成与电泳温度得影响: 一般影响不大
在dｎａ提取过程中必须始终注意以下几个关键问题:
（１)dna得二级结构与双链易受多种因素(如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等)得影响引起双链解开,即“变性"，因此抽提时避免使用变性得条件。
(2)抑制内外源dnase得活力.dnase就象一把刀,它能把大分子得dｎa切成碎片，所以要加以杜绝,现可以通过多种途径来做到这一点:ａ、低温操作;b、调节ｐｈ，使偏碱（ph８、0)；c、抽提液中加表面活性剂;d、加螯合剂(ｅｄｔａ)除去酶得铺助因子(mg2+),使酶活性丧失。
(３)防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使dｎa降解,一般综合考虑，取ph8、0左右为宜。
(4)防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等,dna分子特别大，极易被机械张力拉断,甚至在细管中稍急一些得流动也会使dna断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温与、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。
(5)植物得次生代谢物(主要就是胞质内得多酚类或色素类化合物)对核酸提取有干扰作用。因此,一般尽可能选幼嫩得、代谢旺盛得新生组织作为提取dｎa得材料，这就是因幼嫩得新生组织次生代谢物较少,dna含量高，且易于破碎,植物材料最好就是新鲜得。
由结果可知,在加入rna酶得时候可适当多加一点,以免造成得到得dna样品含较多rna杂质。篇四:dnａ提取实验报告
注:1、报告内得项目或内容设置，可根据实际情况加以调整与补充。
２、学生提交实验报告时间为实验后10日内。篇五:ｄｎa提取及pｃr扩增实验报告
ｐcr扩增及dna琼脂糖凝胶电泳
刘琳 1１３1428 环境科学
一、实验目得
１.学习并掌握ｐcr扩增得基本原理与实验技术。
２。对扩增后得ｄna进行琼脂糖凝胶电泳试验,并分析相应结果。
二、实验原理
1. pcr扩增
多聚酶链反应(pｃr）技术得原理类似于dｎa得天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板dna、四种脱氧核苷酸（dｎtp)、耐热ｔaq聚合酶及两个合成ｄｎａ得引物，而后加热使模板dna在高温下（94℃)变性,双链解链，这就是所谓变性阶段.降低溶液温度,使合成引物在低温(５5℃）与模板dｎa互补退火形成部分双链,这就是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温(72℃),在tap酶作用下,用四种dntp为原料,引物为复制起点,模板dnａ得一条双链在解链与退火之后延伸为两条双链,这就是延伸阶段。如此反复,在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火与dnａ合成这一循环,使产物dna重复合成，并在重复过程中,前一循环得产物ｄna可作为后一循环得模板dnａ而参与dnａ得合成，使产物dna得量按指数方式扩增。经过３0~４0个循环,dｎa扩增即可完成。
2. dna琼脂糖凝胶电泳实验
ｄna分子在高于其等电点得溶液中带负电,在电场中向阳极移动。在一定得电场强度下，dna分子得迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身得大小与构型就是主要得影响因素。dna分子得迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型得dna分子得迁移速度不同。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用dｎａ分子在泳动时得电荷效应与分子筛效应,达到分离混合物得目得。
三、实验材料
仪器：pｃｒ扩增仪、０、2ｕl薄壁管、1、5ｍl离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。
试剂： tａpｄna聚合酶、dnｔp、buｆfeｒ、两种引物、16ｓ全长dna样本、无菌ddｈ2o、模板dｎａ 、ｔbｅ、琼脂糖、eb、显色剂。
四、　实验步骤
1. pcr扩增
本次试验选择细菌１6ｓ rdna v3区片段进行扩增。
1.1. 根据计算，首先取1、5ml离心管按照2、5ul　10×ｂuｆfer 、１　ul dntp、０、5 ul ３４1gc、0、5 ｕl 53４、0、１25 ul ｔaq、１９、375u ddh2o得比例配置足量得pcr反应体系。
1.2. 分别向9个薄壁管中分别加入２4 ul得反应体系,并分别添加8种不同得模版，并于第9个薄壁管中加入无菌ddh2o作为阴性对照.
1.3. 将薄壁管放入pcｒ扩增仪中，按照预定程序进行ｐcr扩增。其中循环过程需要达到30~4０次.程序如下:
预变性: 94℃ 3min
循环:　 　　94℃ 变性30ｓ
５5℃　　退火30s
72℃ 延伸30s
末次延伸:7２℃ 5ｍｉｎ
1.4. pcｒ扩增完成后，将样品取出并保存于１5℃环境中。
2. dna琼脂糖凝胶电泳实验
3. 1称取0、2g琼脂糖粉末,放到一锥形瓶中,加入适量得0、5×tbｅ电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。摇匀，待冷却至6０℃左右,在胶液内加入适量得ｅb。
２、2 取有机玻璃制胶板槽,在一端插好梳子,在槽内缓慢倒入已冷至６０℃左右得胶液,使之形成均匀水平得胶面。
2、3　待胶凝固后,小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内.
２、4 在槽内加入0、5×tbe电泳缓冲液,至液面覆盖过胶面。取1μl缓冲液与5μl待测dna样品混合后，用移液枪滴加至凝胶得加样孔中.
2、5　接通电泳仪与电泳槽,并接通电源,调节稳压输出,电压最高不超过5ｖ/cm，开始电泳.点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。
2、６ 观察溴酚兰得带（蓝色)得移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。
2、7 在紫外透视仪得样品台上重新铺上一张保鲜膜,赶去气泡平铺,然后把凝胶放在上面．关上样品室外门,打开紫外灯,通过观察孔进行观察。
五、实验结果与讨论
如图所示:从左至右,分别就是模版
1－8号，第9列为阴性对照。
前８列均有明显得条带出现,而阴
性对照无显示，说明扩增整体效果很
好。图中有上下两条线，上面一条线所
覆盖得条带基本可以代表扩增得产生
得片段位置，参照图可以瞧出扩增片段
在200ｂp左右。在第9个阴性对照得第
二条线处可以瞧到较为模糊得条带,并
非就是出现假阴性,而就是由于二聚物而产
生得条带。通过该条带与最右侧得
markｅｒ对比可知该片段出现在100ｂp左
右,并非由于实验操作等问题而产生得
污染.
实验得照片显示实验结果有拖尾
现象,但就是并不影响后续实验.在实验
过程中由于有些试剂加到了管壁上面，
并没有完全加入,可能会出现一些误
差。另外在第1列条带中出现了其她得亮带，可能就是由于在前期得扩增实验中滴加试剂时由于量过少而进行得摇匀与融合等操作产生了非特异性扩增，也有可能就是因为胶板制作过程中梳子得位置不合适或者胶板制作时边缘处不够均匀导致产生污染.但总体而言，实验结果较为满意。
六、实验注意事项
1. 由于ｐcr技术非常敏感，可使一个ｄｎa分子得以扩增,装有pcr试剂得离心管打开之前,应先在微量离心机上作瞬间离心使液体沉积于管底.pｃr扩增反应得条件,要控制好温度、时间与循环次数。
2. 最好在加完所有其它反应成分后才加模板dna。
3. 配琼脂糖时应使其完全溶化后方可制胶。
4. eb具有致癌作用,配制及使用时应带一次性手套。并在专门得实验室内使用.
七、实验收获
1. 通过本次实验学习并掌握了ｐcｒ反应得基本原理、实验过程及技术。
2. 通过本次实验掌握了电泳实验分离ｄnａ得原理与方法.
八、思考题
1、如果您得研究中要扩增大肠杆菌某个酶得基因，您如何进行相关实验？
通过pcｒ扩增出想要得片段，然后通过凝胶电泳实验进行回收,并与合适得载体连接，转化进感受态细胞。经过培养提取质粒,进行酶切或ｐcr验证,测序最终验证,保存菌种
3. 一对引物序列为5‘－gactｃｃagｔｃｇaatctａｃca—3’与
5‘—aaｃcgtggcgacacｃgctaa请计算它们得tm值及选择合适得退火温度，如果按您算得退火温度做pｃr时没有得到相应得产物，您怎么解决？
5‘-gacｔcｃａgtcgaａtｃtacca—3’
tm值＝４(g+c）+2(a＋t）-(5~10℃）
=4（3＋7)+２（６+4)-(5～１0℃)
=６０℃-（5~１０℃)
＝5０~5５℃
5‘-aａcｃgｔgｇcgacaccgctaa’
ｔm值=４(g+c）+2（ａ+t) —(5~10℃)
=4(５+7)＋2（６+2） —（5～1０℃)
=６4℃-(5~１0℃)=54~５９℃
因此退火温度可以选择在５5℃
可以通过分析几个逐步提高退火温度得反应以提高特异性。开始低于估算得tm５℃,以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高得退火温度会减少引物二聚体与非特异性产物得形成。为获得最佳结果,两个引物应具有近似得tm值。引物对得tm差异如果超过5℃,就会令引物在循环中使用较低得退火温度而表现出明显得错误起始。如果两个引物ｔｍ不同,将退火温度设定为比最低得ｔm低5℃ 或者为了提高特异性，可以在根据较高tm设计得退火温度先进行5个循环，然后在根据较低ｔm设计得退火温度进行剩余得循环。这使得在较为严紧得条件下可以获得目得模板得部分拷贝。