生物技术的工程应用(一).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,动物克隆技术,转基因技术,基因敲除技术,基因治疗,干细胞技术,单克隆抗体制备技术,1,“多莉”克隆成功,1997,年,2,月,22,日，,Nature,英国爱丁堡罗斯林研究所,2,克隆的概念,Clone,无性系或无性繁殖系。,做为名词,：从一个共同的祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊生命群体；,做为动词,：指从一个共同祖先产生这一特殊生命群体的过程。,一种人工诱导的无性繁殖方式,3,细胞核移植研究,细胞核遗传全能性研究,二十世纪60年代,第一个用成体细胞核成功克隆动物,JOHN GURDON(1933-),6,胚胎细胞克隆研究,1981年，Illmenses率先报告用小鼠幼胚细胞核克隆出正常小鼠。,1986年，Willadsen等用未发育成熟的羊胚细胞的细胞核克隆出一头羊。,1987年，克隆牛。,1988年，克隆兔。,1989年，克隆猪。,二十世纪80年代开始，我国先后在五种动物上取得成功,其中包括兔、山羊、牛、猪、小鼠。,7,体细胞克隆研究,1996年7月5日，“,多莉,”降临人世。1997年2月这个重大结果才被公布。,1998年7月，美国科学家宣布三代克隆,鼠,诞生。,1999年5月，美国科学家宣布,雄性克隆鼠,克隆成功，这是世界上第一只用体细胞克隆出的雄性哺乳动物。,1999年，美籍华人科学家杨向中领导的研究小组用一头13岁高龄的,母牛,耳朵上取出的细胞克隆出小牛。,8,2000年，杨向中教授用体外长期培养后的,公牛,耳皮细胞成功克隆出6头牛犊。,2000年，克隆,猴,成功。,2000年，克隆,猪,成功。,2003年，美国研究人员用冷冻20多年的爪哇野牛皮肤细胞成功克隆出两头爪哇野牛，为保护,濒危动物,带来了新希望。,9,2003年，雄性克隆骡在美国培育成功，该研究为从基因角度无法繁殖后代的,杂种动物,繁衍后代提供了新的途径。,2004年，美国和韩国科学家成功克隆出人类早期胚胎，并从中提取出胚胎干细胞，这是科学家首次利用克隆技术获得,人类胚胎干细胞,。,10,“多莉”诞生的重要生物学意义,证明一个已经完全分化了的动物体细胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息，并且体细胞可恢复失去的全能性形成完整个体。,在培育体细胞成为核供体之前，人们可以利用“基因靶”技术精确地诱发核基因的遗传改变或精确地植入目的基因，从而可以按照人的意志去改选、生产物种,。,利用克隆技术复制哺乳类动物的最后技术障碍已被突破，在理论上已成为可能。,11,核移植技术的一般操作程序,核受体,和,核供体,的处理和制备,核移植,重组胚的体外或体内,培养,核移植胚胎,移,入代孕母畜（寄母）体内,12,1,2,3,13,1.核受体细胞的准备,去核卵母细胞,卵母细胞的来源：,用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体内成熟的卵母细胞。,从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘,卵母细胞复合体，在体外培养成熟后作为受体。,14,2.核供体细胞的准备,核供体细胞必须具备的条件：,必须是完整的,二倍体,，该细胞必须保持有供体动物,完整的基因组,。,供体细胞核必须能够在受体细胞细胞质的作用下，产生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新完成从受精卵发育成一个正常动物个体的全过程。,胚胎卵裂球、,体细胞,、胚胎干细胞、胎儿成纤维细胞等。,15,3.细胞核移植,胞质内注射,：用一个外径58m 的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。,透明带下注射,：把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合。,16,4.重组胚的激活,通过化学激活、电脉冲等方法，使卵母细胞进入到“受精”的状态。,17,5.重组胚的体内或体外培养,体内培养,：羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养4-7d，发育至桑椹胚和囊胚。猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内培养7d，发育为囊胚。,体外培养,：大鼠、小鼠和兔的核移植胚多采用体外培养，发育至桑椹胚或囊胚。,18,6.胚胎移植,受体母畜选择条件：,皮毛颜色与供体品种不同,繁殖性能强、体格稍大的当地品种,进行同期发情处理,按常规方法将重组克隆胚胎移植至代孕母畜（寄母）的子宫中，待其发育到产仔。,19,“多莉”的诞生过程,核供体细胞的准备,：,6岁母绵羊（白面母羊）的乳腺细胞，饥饿法使其进入休眠状态而使全部基因具有活性。,核供体细胞的准备,：,注射促性腺激素，促使母羊（黑面母绵羊）排卵，2833小时取其未受精卵，快速去核，放入10%FCS、1%FCS和0.5%FCS连续5天，使其进入G0期做受体细胞。,核移植及重组胚激活,重组胚的体内培养,：,新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内，6天后发育为桑椹胚或囊胚（816个细胞）。,胚胎移植,：,将早期胚胎移入假孕母羊子宫中，产下“多利”即为6岁母羊的复制品，也为白色,20,动物克隆技术存在的问题,分化的体细胞克隆对遗传物质重编（在细胞核内所有或大部分基因关闭的基础上，细胞重新恢复全能性）的机理还不清楚。,克隆动物是否会记住供体细胞的年龄？,克隆动物的连续后代是否会累积突变基因？,在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用是什么？,成功率低!,部分个体表现出生理或免疫缺限。,21,克隆存在的伦理问题,22,1982,年，,Nature,将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中，培育出具快速生长效应的“,转基因超级鼠,”。,转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快,2,3,倍，体积大一倍。,23,转基因技术,将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状发生可遗传的修饰，称之为转基因技术。,转基因动物：用实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。,24,转基因的方法,逆转录病毒感染法,：这是最早用来得到转基因小鼠的方法。,显微注射法,：,将,DNA,注射到胚胎的细胞核内，再把注射过,DNA,的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。,精子载体技术,：利用精子为媒介，将外源,DNA,带入到目的细胞中并稳定表达。,电转移技术,：利用一定强度的脉冲刺激，使外源,DNA,进入受精卵。,基因打靶,：利用基因同源重组的原理，把目标基因插入到染色体制定位点的一项分子生物学技术。,脂质体转染法,人工酵母染色体法,体细胞,克隆生产转基因动物,25,转基因动物的应用前景,研究基因的结构与功能，了解动物生命现象的内在本质。,建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及治疗方法。,人异种器官移植,改善动物生产性能，提高动物育种效率。,制备医用或食用蛋白的生物反应器。如：通过动物乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白。,26,生物反应器,利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的,器官,或,组织,来进行,工业化,生产,活性功能蛋白,的技术。,细胞,生物反应器、,乳腺,生物反应器、,血液,生物反应器、,卵,生物反应器、,尿,生物反应器、,精囊腺,生物反应器、,唾液,生物反应器等。,哺乳动物,反应器、,家禽,生物反应器、,家蚕,生物反应器等。,27,转基因山羊活动的制药厂,药用蛋白基因,转基因山羊。,分泌的乳汁里就会含有药用蛋白。,成熟的转基因山羊会与非转基因山羊配种，它们繁殖的后代同样带有药用蛋白基因。得到转基因羊群。,28,存在的问题,1、食品安全问题：,未知的可能副作用？,外源基因在人体内表达？,2、技术问题：,成本高；,成功率低、成活率低（0.2%4.4%）；,基因组是否能够有效整合、稳定遗传？,29,患上精神分裂症的老鼠,名为,DISC1,的基因的改变是诱发精神分裂症的重要原因。,缺乏这种基因的老鼠会患上精神分裂症。,30,基因敲除技术,采用,基因同源重组,的方法，用体外合成的,无效基因,或,突变基因,取代相应正常基因，再应用转基因方法孵育出转基因动物，即基因敲除动物。,31,基因敲除技术的技术路线,构建重组基因载体,用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核中,用选择培养基筛选已击中的细胞,将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。,32,基因敲除技术的应用,研究基因调控和基因功能,建立人类疾病的基因敲除动物模型，为医学研究提供材料,改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能，研究发育生物学,治疗遗传病，即基因治疗,改造生物、培育新的生物品种,33,基因治疗,广义,：凡是采用分子生物学的方法和原理，在核酸水平上开展的疾病治疗方法都可称为基因治疗。,狭义,：将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用（也包括剔除或抑制某些导致疾病的基因），从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。,34,实施基因治疗的必要条件,发病机制在,DNA,水平上已经清楚。,要转移的基因已经克隆分离，对其表达产物有详尽的了解。,该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作。,35,基因治疗的策略,基因置换,：用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因。,基因修复,：将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。,基因修饰,：将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有某些功能得以加强。,基因失活,：利用反义技术能特异地封闭基因表达特性，抑制一些有害基因的表达。,免疫调节,：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人免疫状态，达到预防或治疗疾病的目的。,36,基因治疗举例,1990年9月14日，美国一个患有严重免疫缺陷症的4岁小女孩接受基因治疗并获得了成功。,1991年，50名黑色素瘤晚期患者接受了基因治疗。研究者把外源的肿瘤坏死因子转入肿瘤浸润淋巴细胞，结果肿瘤浸润淋巴细胞能集中在肿瘤所在部位杀死肿瘤细胞。,截止2004年1月31日,世界上已有918个基因治疗方案用于临床，治疗病例超过6000例。,37,治疗糖尿病新方法基因治疗,2009年2月27日，日本每日新闻报道,东京慈惠会医科大学,通过向患糖尿病实验鼠的胰腺植入特定基因，可成功使具有降血糖功能的胰腺,b,细胞大幅增殖。,38,移植基因方法可有效抑制艾滋病病毒,Nature Medicine,15 February 2009,洛杉矶加利福尼亚大学,74名感染艾滋病病毒的志愿者,一半志愿者被植入血液干细胞，这些干细胞被含有关键基因（编码核糖核酸酶）的受损病毒所感染，而其他人则植入了无害的相似物质。,实验开始100周后：植入基因者的病毒数量显著减少。,39,帕金森氏症基因治疗方法问世,美国国家科学院学报月刊，2007年11月20日,12名帕金森氏症的患者,患者脑部相关区域会被注射入一种无害的转基因病毒。,在实验后，科学家对接受此种方法治疗的患者进行了脑部扫描。扫描证实，实验中的帕金森氏症患者脑中原本不正常的大脑回路在逐步恢复健康。,40,基因治疗载体可能会激发癌症,Science，2007年7月27日,华盛顿大学,基因治疗载体会激发癌症,“载体基因可能整合到你不希望它整合的位点”,41,干细胞 stem cell,未分化的细胞,具有自我更新（self-renewal）和多向分化潜能（multilineage differentiation）的细胞。,胚胎干细胞,ES,embryonic stem cell,成体干细胞,adult stem cell,42,胚胎干细胞,来自于早期胚胎、原始生殖细胞或畸胎瘤组织的干细胞。,在胚胎发育中，受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团即为胚胎干细胞。,具有形成该生物体所有组织和器官的能力，即“全能性”。,囊胚，受精后57天,43,成体干细胞,胚胎干细胞继续分化，形成的具有特定功能的干细胞,如果无外加条件影响，一种组织的成体干细胞倾向于分化成该组织的各种细胞,是动物体内组织和器官修复再生的基础,人体内几乎所有组织都存在成体干细胞,造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞,特定条件下，一种组织的成体干细胞可以“横向分化”成其他组织的细胞。,44,干细胞的鉴定,根据干细胞的生理特征：,慢周期性,具有自我更新能力,根据干细胞表面标志,如表皮干细胞的表面标志有：整合素、CD34、角蛋白等。,45,干细胞技术,获得干细胞系,对干细胞进行体外诱导分化,诱导分化细胞的永生化,46,干细胞技术的应用,发育生物学的系统工具,：研究胚胎发育过程、基因表达、遗传性疾病的发病机理等。,转基因动物模型的载体,体外分化模型的建立,：研究与干细胞分化相关的基因及蛋白因子。,治疗性克隆,：得到人类胚胎干细胞，并应用于治疗疾病。,药物实验研究和疾病模型建立,：为新药的药理、药效及药物代谢研究提供体外模型。,47,思考,基因工程技术的发展对于人类及自然界究竟是福是祸？,48,单克隆抗体的制备,49,动物细胞融合,在自然条件下或用人工方法（生物、物理、化学等）使两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的过程。,同种细胞之间、异种细胞之间,细胞膜合并、染色体等遗传物质发生重组，形成一个新的有生命的细胞。,常用方法：,病毒诱导融合：如仙台病毒,化学诱导融合：如聚乙二醇（PEG）,电击诱导融合,50,生物导弹弹头单克隆抗体,51,抗体 antibody,是,B淋巴细胞,识别抗原后增殖分化为,浆细胞,所产生的一种蛋白质。,主要存在于血清等体液中。,能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。,52,抗体 antibody,53,抗体免疫球蛋白,抗体,：生物学及功能概念。,免疫球蛋白,：结构及化学概念。,所有,抗体,都是,免疫球蛋白,。,并非所有,免疫球蛋白,都是,抗体,。,54,单克隆抗体？,55,抗原,B淋巴细胞,浆细胞,抗体,分泌,刺激,分化,特异性结合,56,抗原决定簇,又称抗原表位,决定抗原性的特殊化学基团,抗原物质的表面或内部,一个天然抗原物质可有多种和多个决定簇,57,抗原决定簇,1种抗原决定簇,1个B淋巴细胞克隆,1种特异性抗体,58,单抗与多抗,由,一种,抗原决定簇刺激机体，从而产生的只针对该抗原决定簇的抗体分子称为,单克隆抗体,。,由,多种,抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是,多克隆抗体,。,单克隆抗体 monoclonal antibody，mAb,多克隆抗体 polyclonal antibody，pAb,59,单克隆抗体技术,用,骨髓瘤细胞,与经特定抗原免疫刺激的,B淋巴细胞,融合得到,杂交瘤细胞,。,杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在,体外无限增殖,，又具有B淋巴细胞,产生特异性抗体的能力,。,单克隆抗体技术又称为,杂交瘤技术,。,60,抗原,1,2,3,4,脾,B细胞,1,2,3,4,骨髓瘤小鼠取腹水,骨髓瘤细胞,细胞融合,经HAT培养基筛选得到杂交瘤细胞,Ab1,抗血清,Ab1,Ab2,Ab3,Ab4,Ab2,Ab3,Ab4,普通抗血清（多克隆抗体）,单克隆抗体,Ab1,Ab3,Ab4,Ab2,61,动物免疫,分离脾细胞,制备骨髓瘤细胞,细胞融合,HAT培养基选择杂交瘤细胞,阳性细胞克隆化并扩大培养,再次克隆,克隆扩大培养,扩大培养收集上清液,动物接种收集腹水,单克隆抗体纯化保存,ELISA测血清,62,思考题,有多少种细胞将经过HAT培养基的筛选考验？,63,细胞DNA合成的两条途径,从头合成途径：,由戊糖和磷酸合成核苷酸，进而合成DNA，,叶酸,作为重要的还原辅助因子参与反应。,补救合成途径：,在次黄嘌呤（,H,）和胸腺嘧啶核苷（,T,）存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（,HGPRT,）和胸腺嘧啶核苷激酶（,TK,）的催化下合成DNA。,64,HAT培养基的作用机理,H,次黄嘌呤,A,氨基蝶呤,T,胸腺嘧啶核苷,氨基蝶呤(A),是叶酸类似物，可以抑制二氢叶酸还原酶，从而使叶酸得不到补充而耗竭，导致细胞无法经从头合成途径合成DNA。,65,HAT培养基的作用机理,骨髓瘤细胞,是,HGPRT缺陷,细胞，自身不能通过补救合成途径合成DNA而增殖。,B淋巴细胞,虽含有HGPRT，但不能在体外培养无限期存活（,只存活57d,）。,杂交瘤细胞,由B细胞和骨髓瘤细胞融合而成，可利用B细胞的HGPRT通过补救合成途径合成DNA而存活。,66,HAT培养基的作用机理,HGPRT,缺陷,DNA补救,合成途径,杂交瘤细胞,DNA,补救,合成途径,DNA,补救,合成途径,DNA从头,合成途径,氨基喋呤,抑制叶酸,氨基喋呤,抑制叶酸,氨基喋呤,抑制叶酸,DNA从头,合成途径,DNA从头,合成途径,骨髓瘤细胞,B细胞,寿命仅,57d,67,丹麦 19111994,提出免疫学系统基本知识,德国 19461995,第一次制备了单克隆抗体,阿根廷 19272002,第一次制备了单克隆抗体,68,有限稀释法：,将细胞悬液逐次稀释后加入培养孔，可获得单个细胞形成的克隆，选择高分泌抗体的细胞株扩大培养或冻存。,显微操作法：,在倒置显微镜下吸出单个细胞培养。,软琼脂平板法：,细胞克隆形成后用显微操作法将单个克隆的细胞转移至液体培养基中培养。,细胞分选仪法：,流式细胞仪分选。,融合细胞克隆化并扩大培养,69,刚融合完成,一个骨髓瘤细胞与两个脾细胞,经数次分裂后,稳定的细胞群落,70,单克隆抗体的制备、纯化,单抗的扩大培养,：,体外细胞株扩大培养，取上清液提纯。,接种小鼠腹腔，取腹水提纯。,单抗的纯化,：通常按抗体纯化步骤进行，常用,亲和柱层析法,。,71,单克隆抗体的用途,生命科学研究工具,医学疾病诊断与治疗,农业,食品检测,环境检测,其他,72,单克隆抗体的用途医学,导向治疗作用,mAb,的特点为高度的特异性，因而能准确识别靶器官上的特异性抗原决定簇。将治疗药物等细胞毒制剂与针对肿瘤抗原的,mAb,相结合，利用,mAb,的导向作用，将药物或毒素携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为“,导向药物,”或“,生物导弹,”。,73,单克隆抗体的用途医学,医学检验试剂,mAb,以其纯度高、特异性强、敏感度高等优点，逐步取代了多克隆抗体试剂，减少了血清学上的交叉反应，提高血清学实验诊断特异性和敏感性，,mAb,高度的生化均一性和生物活性单一性。,制备疾病诊断试剂盒及定位诊断。,74,单克隆抗体的用途医学,医学检验试剂,病原微生物抗原、抗体的检测。,肿瘤抗原的检测。,免疫细胞及其亚群的检测。,激素测定。,细胞因子的测定。,75,单克隆抗体的用途医学,抗原物质的分离和提纯,基因工程,mAb,技术的开展，可生产出人源,mAb,及其片段，将进一步促进其在临床方面更广泛的应用。,76,单克隆抗体的应用,酶联免疫吸附反应,艾知（艾滋病快速诊断试剂盒）,西妥昔单抗,77,