蛋白组学导论.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,什么是蛋白质组学,(What is proteomic),？,1,、,Omics,是源于希腊语，在牛津大辞典里面对其解释的第三条是“在细胞和分子生物学中，作为名词的词缀，表示整体的，综合性的研究所有的组成成分。”,2,、于是，基因组学（,genomics,），转录组学（,transcrptomics,），蛋白组学（,proteomics,），代谢组学（,Metabolomics,，,Metabonomics,），脂质组学（,lipidomics,），食品组学（,Foodomics).,3,、,蛋白质组学,指用高通量的手段，定性定量的表征细胞、组织或有机体在不同的时空条件下蛋白表达状态。,蛋白质组学研究内涵,1,、研究细胞、组织或者生物个体在某个特定条件下所有的蛋白表达情况,(Expression Proteomics,，表达蛋白组学）；,2,、研究这些所有表达的蛋白之间的相互作用关系（,InteractionProteomics,，互作蛋白组学）；,3,、研究这些所有的蛋白的翻译后修饰变化情况（,Post translational proteomics,，修饰蛋白组学）；,4,、研究这些表达的蛋白的三维结构与功能的关系，为可能的药物靶点研究提供依据（,Structure Proteomics,）；,5,、寻找可靠的生物标志物（,Biomarker),；,蛋白质表征：传统手段,vs,蛋白质组学分析,传统手段,质谱手段,蛋白质组学能够高通量、高灵敏、高可信度地分析复杂样本,为何要研究蛋白质组学？,Lysis buffer,(SDT,RIPA),Detergent:SDS,CHAPS,NP40,（和质谱不兼容）,Urea(,和质谱兼容,),，,破坏细胞膜，蛋白质变性,Reducing agent:DTT,打开二硫键，使得蛋白质结构更为开放，更易酶解,蛋白质组学的研究流程,-,蛋白质抽提,组织块,一般组织块的蛋白含量约为组织自重的,10%,1a.,在裂解液中匀浆,1b.,液氮碾磨,2.,在裂解液中超声,打断,cell lysate,中,DNA,降低样品粘度,蛋白质抽提,蛋白质组学的研究流程,酶解示意图,蛋白酶的选择,最为常用的蛋白酶,:,Trypsin,（胰蛋白酶）,特异的切断,C,端为,Arg,Lys,的肽键,（若,Arg,Lys,紧跟,Proline,后面,酶切效率降低）,生成的肽段平均长度为,9,个氨基酸,胰酶酶解生成的肽段至少为,2+,价，易于离子化,其他酶：,蛋白质组学的研究流程,-,蛋白质酶解,蛋白质水平预分级,1.,SDS-PAGE,胶分离,2.,液相分离,分子筛、阴,/,阳离子交换色谱、,亲和色谱等等,蛋白质组学的研究流程,-,复杂蛋白质组分预分离,多肽水平预分级,为了实现对肽段的预分级,色谱方法间必须存在正交性,蛋白质组学的研究流程,-,复杂蛋白质组分预分离,Electrospray Ionization(ESI),(ESI),蛋白质组学的研究流程,-,质谱前端,Matrix-Assisted Laser-Desorption,Ionization(MALDI),不能与,Nano-LC,联用,适合成分简单样本的样本分析,常与,Nano-LC,联用,适合成分复杂，带电物质的样本分析,质谱同时扫描批量的多肽分子，形成一张,full scan,图谱，记录某一时间点时所有,质谱采集到的物质信号。,蛋白质组学的研究流程,-,质谱一级扫描,HCD/CID,蛋白质组学的研究流程,-,多肽碎裂及数据依赖性二级扫描,数据依赖性采集模式：,1.Intensity Based,2.Charge Based,3.,蛋白质组学的研究流程,-,数据分析,定性蛋白质组学与定量蛋白质组学,定性蛋白质组,通过质谱对目标分析物进行属性鉴定,17,种成人组织，,7,种胎儿组织，,6,种人造血细胞,共鉴定,17294,非冗余蛋白，覆盖,84%,人类基因,人类蛋白质组实现接近完全覆盖,方法：,Database,search/,Denove,测序,经典案例,定性蛋白质组,最常规，最普遍的蛋白质,鉴定方法,.,数据库搜索,Denovo,测序,定性蛋白质组,定量蛋白质组,研究组织或者生物个体蛋白的量，表征在不同条件下细胞的蛋白差异表达。,SILAC,(,母离子峰面积,),相对定量,同位素,标记,非标定量,化学标记（,报告离子,）,DIA/Swath(,子离子,),LabelFree(,母离子,),绝对定量,SRM,PRM,定量方法,相对定量,-,同位素标记定量,1.,代谢标记定量：,SILAC,（哺乳动物）,15N,（植物，,微生物）,18O,等，基于,一级质谱的定量,.,2.,化学试剂定量：,iTRAQ,，,TMT,；基于二级质谱强,度的定量方法,相对定量,-,非标记定量,所谓非标记定量，就是不进行任何修饰而通过对独立样本间进行标记定量,Label Free:,基于母离子,XIC,的定量方法。,SWATH/DIA,：基于碎片子离子,XIC,的定量方法,排除了共洗脱多肽的干扰；,多个离子对进行加权平均，,定量更精准,;,消耗机时，重复性差,非标记无需特殊前处理，简单,；,但,是需要重复（至少三次），耗机时，准确性也稍差。,绝对定量,同位素标准多肽,同位素标准多肽,蛋白质组学研究总述,蛋白质组学平台总览,质谱数据采集,样品制备,数据分析,Orbitrap Fusion,三合一质谱仪,蛋白组学研究利器,;,中心投入最大的仪器与平台,;,可实现所有蛋白质组学研究项目的,需要。,Orbitrap Fusion,质谱仪,谢谢大家,