常用分子生物学技术的原理及应用.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目 录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目 录,第二十二章,常用分子生物学技术的原理及应用,The Popular Technology in Molecular Biology:Principle and Application,第 一 节,分子杂交与印迹技术,Molecular Hybridization&Blotting Technology,核酸分子杂交,(nucleic acid hybridization),在,DNA,复性过程中，如果把不同,DNA,单链分子放在同一溶液中，或把,DNA,与,RNA,放在一起，只要在,DNA,或,RNA,的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链,(,heteroduplex,),。,一、分子杂交与印迹技术的原理,复性,RNA,DNA,（一）印迹技术,（二）探针技术,探针,(probe),一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在,NC,膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,二、印迹技术的类别及应用,（一）,DNA,印迹技术,(Southern blotting),用于基因组,DNA,、重组质粒和噬菌体的分析。,（二）,RNA,印迹技术,(Northern blotting),用于,RNA,的定性定量分析。,（三）蛋白质的印迹分析,(Western blotting),用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,其他,斑点印,迹,(,dot blotting),原位杂交,(in situ hybridization),DNA,点阵,(DNA array),DNA,芯片技术,(DNA chip),三种印迹技术的比较,分子杂交实验,目 录,放射自显影照片,目 录,DNA,点阵,目 录,第 二 节,聚 合 酶 链 反 应,Polymerase Chain Reaction,5,Primer 1,5,Primer 2,Cycle 2,Cycle 1,5,5,5,5,5,5,Template DNA,5,5,5,5,5,5,5,5,一、基本工作原理,目 录,Cycle 3,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,25,30,次循环后，模板,DNA,的含量可以扩大,100,万倍以上。,目 录,模板,DNA,特异性引物,耐热,DNA,聚合酶,dNTPs,Mg,2+,二、,PCR,体系基本组成成分,三、,PCR,的基本反应步骤,变性,95,C,延伸,72,C,退火,Tm-5,C,（一）目的基因的克隆,（二）基因的体外突变,（三）,DNA,和,RNA,的微量分析,（四）,DNA,序列测定,（五）基因突变分析,四、,PCR,的主要用途,三、几种重要的,PCR,衍生技术,（一）反转录,PCR,技术,（二）原位,PCR,技术,（三）实时,PCR,技术,实时,PCR,技术原理,目 录,第 三 节 核 酸 序 列 分 析,Nucleic Acid Sequence Analysis,核酸序列分析的基本原理,化学裂解法,(Maxam-Gillbert,法,),DNA,链的末端合成终止法,(sanger,法,),一、化学裂解法,(,Maxam-Gillbert,法,),基本原理,基于某些化学试剂可以使,DNA,链在,1,个或,2,个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的,DNA,片段，将这些片段经电泳分离。,分析前，用同位素标记,DNA,的,5,末端，经放射自显影即可在,X,胶片上读出,DNA,链的序列。,二、,DNA,链末端合成终止法,目 录,三、,DNA,自动测序,采用荧光替代放射性核素标记是实现,DNA,序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行,Sanger,测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小,DNA,片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定,DNA,碱基的排列顺序。,DNA,自动测序结果举例,目 录,基 因 文 库,Gene Library,第 四 节,基因组,DNA,文库,(genomic DNA library),cDNA,文库,(cDNA,library),基因文库,(gene library),是指一个包含了某一生物体全部,DNA,序列的克隆群体。,基因组,DNA,文库,目 录,第一轮筛选,第二轮筛选,第三轮筛选,基因组文库筛选结果举例,疾病相关基因的克隆与鉴定,Cloning and Identification of Disease Relative Genes,第 五 节,克隆疾病相关基因的策略,（一）功能性克隆,(,functional cloning,),（二）定位克隆,(positional cloning),（三）非定位候选基因克隆策略,(position-,independent candidate gene approaches),（四）定位候选基因克隆策略,(positional,candidate gene approaches),定义,从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。,（一）功能性克隆,应用,生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。,克隆方式,利用特异性抗体筛选表达型,cDNA,文库；,根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选,cDNA,文库。,功能互补试验,(functional complementation assay),利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。,（二）定位克隆,定义,从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。,系统的定位克隆工作,遗传学分析,(,确定致病基因染色体定位,),交换分析、连锁不平衡分析,分子生物学分析,染色体异常,(,缺失、易位等,),分析、基因文库的筛选与基因克隆,（三）非定位候选基因克隆策略,由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。,（四）定位候选基因克隆策略,当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。,第 六 节,遗传修饰动物模型的建立及应用,The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model,转基因技术,采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。,转基因,被导入的目的基因,转基因动物,(,transgenic animal),目的基因的受体动物,一、转基因技术,核转移技术,即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆,(,clone),。,二、核转移技术,目 录,基因剔除技术,也称基因靶向,(,gene targeting,),灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。,三、基因剔除技术,四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用,建立动物模型,单基因决定疾病模型,基因剔除,获得性突变,(gain-of-function mutation),多基因决定疾病模型,第 七 节,生 物 芯 片 技 术,Biological Chip Technology,DNA,芯片,(DNA chip),cDNA,芯片,(cDNA,chip),是指将许多特定的,DNA,片段或,cDNA,片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上,。,一、基因芯片,(,gene chip),目 录,是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,二、蛋白质芯片,蛋白质芯片,(protein chip),第 八 节,蛋白质相互作用研究技术,Research Technology of Interaction of Protein,蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括,DNA,的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。,蛋白质之间相互作用研究的重要性,酵母双杂交,各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）,荧光共振能量转换效应分析,噬菌体显示系统筛选等等,常用蛋白质相互作用的研究技术,一、酵母双杂交技术的基本原理,目 录,二、酵母双杂交系统的应用,（一）分析已知蛋白之间的相互作用,（二）对蛋白质功能域的分析,（三）分析未知蛋白相互作用,（四）绘制蛋白质相互作用系统图谱,（五）在药物设计中的应用,