微生物生长繁殖五.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,第五章,微生物的生长,繁殖与生存因子,生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体,体积扩大的生物学过程。,生长：,生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的,生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。,繁殖：,生长是一个逐步发生的,量变过程,，,繁殖是一个产生新的生命个体的,质变过程,。,在,高等生物,里这两个过程可以明显分开，但在低等特别是在,单,细胞的生物,里，由于细胞小，这两个过程是紧密联系又很难划,分的过程。,第一节 微生物的生长繁殖,一个微生物细胞,合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。,如果同化作用的速度超过了异化作用,个体的生长,原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加,如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就,会发生繁殖，引起个体数目的增加。,群体内各个个体的进一步生长,群体的生长,一、微生物生长的测定,:,单位时间里微生物数量或生物量（,Biomass）,的变化,微生物生长：,微生物生长的测定：,个体计数,群体重量测定,群体生理指标测定,评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；,评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；,客观地反映微生物生长的规律；,（一）以数量变化对微生物生长情况进行测定,1、培养平板计数法,采用培养平板计数法要求操作熟练,、准确，否则难以得到正确的结果：,样品充分混匀；,每支移液管及涂布棒只能接触一个,稀释度的菌液；,同一稀释度三个以上重复,取平均值；,每个平板上的菌落数目合适，便于,准确计数；,一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用,菌落形成单位（,colony forming units，CFU）,来表示，而,不是直接表示为细胞数。,2、膜过滤培养法,当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样,品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形,成的菌落进行统计。,3、,The most probable number method（,液体稀释法）,主要适用于只能进行液体培养的微生,物，或采用液体鉴别培养基进行直接,鉴定并计数的微生物。,对未知样品进行十倍稀释，然后根据估算取三个连续的稀释度,平行接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况进行统,计，长菌的为阳性，未长菌的为阴性，然后根据数学统计计算,出样品中的微生物数目。,4、显微镜直接计数法,1）常规方法：,缺点：,不能区分死菌与活菌；,不适于对运动细菌的计数；,需要相对高的细菌浓度；,个体小的细菌在显微镜下难以观察；,2）其它方法：,将已知颗粒浓度的样品（例如血液）与待测细胞细胞浓度的样品混匀,后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。,比例计数：,过滤计数：,当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品,通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显,微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数；,活菌计数：,采用特定的染色技术也可分别对活菌和死菌进行分别计数,（二）以生物量为指标测定微生物的生长,1、比浊法,在一定波长下，测定菌悬液的光密,度，以光密度(,optical density,即,O.D.),表示菌量。,实验测量时应控制在菌浓度与光密度,成正比的线性范围内，否则不准确。,2,、生理指标法,微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、,生物热等与其群体的规模成正相关。,样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，,因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量,热计等设备来测定相应的指标。,常用于对微生物的快速鉴定与检测,二、细菌的群体生长繁殖,微生物的特点：,个体微小,肉眼看到或接触到的微生物是成千上万个,单个的微生物组成的群体。,微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。,对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础,一、生长曲线,生长曲线(,Growth Curve)：,细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，,以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细,菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。,在微生物学中提到的“生长”，均指群体生长。,细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图,一条典型的生长曲线至少可以分为,迟缓期,，,对数期,，,稳定期,和,衰亡期,等四个生长时期,迟缓期(,Lag phase)：,将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，,或增加很少，生长速度接近于零。也称,延迟期,、,适应期,。,迟缓期的特点,：,分裂迟缓、代谢活跃,细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞,的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞,体积最大,细胞内,RNA，,尤其是,rRNA,含量增高，合成代谢活跃，核糖体、,酶类和,ATP,的合成加快，易产生诱导酶。,对外界不良条件反应敏感。,细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓,在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。,对数生长期(,Log phase)：,又称指数生长期(,Exponential phase),以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加，,细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。,对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长,迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作,种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。,稳定生长期(,Stationary phase)：,由于营养物质消耗，代谢产物积累和,pH,等环境变化，逐步不适宜,于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等,于细菌死亡数)。,稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数,最高并维持稳定。,衰亡期(,Decline,或,Death phase)：,营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生,速率，整个群体呈现出负增长。,该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分,细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。,二、同步培养,同步培养(,Synchronous culture)：,使群体中的细胞处于比较一致的，生长发育均处于同一阶,段上，即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。,以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时,进行分裂的生长。,同步生长：,通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物,硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法,由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，,随后又逐渐转变为随机生长。,三、连续培养,将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。,分批培养（,batch culture）or,封闭培养（,closed culture）,培养基一次加入，不予补充，不再更换。,连续培养(,Continous culture）,在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定,的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。,培养过程中不断的,补充营养物质,和以同样的速率,移出培养物,是,实现微生物连续培养的基本原则。,（一）恒浊连续培养,测定所培养微生物的光密度值,自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速,使培养物维持在某一恒定浊度,当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；,当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；,恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的,如果所用培养基中有过量的必需营养物，就可以使菌体维持最高的,生长速率。,二）恒化连续培养,使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高,生长速率下进行生长繁殖。,通过控制流速可以得到生长速率不同但密度基本恒定的培养物,多用于科研,遗传学：突变株分离；,生理学：不同条件下的代谢变化；,生态学：模拟自然营养条件建立实验模型；,第六章微生物的营养和产能代谢,第一节,微生物的营养物质,微生物的营养物质按其在机体中的生理作用可区分为：,碳源、氮源、无机盐、生长因子和水五大类。,(一)、碳源,1、定义：,任何作为构成微生物的细胞物质或其代谢产物中碳素来源的营养物质。,2、功能：,(1),构成微生物自身细胞物质和代谢产物,；,能源物质,；,所以，碳源不足会引起菌体衰老或死亡。,但有些又以,CO2,为唯一或主要碳源的微生物生长所需的能源则不是来自,CO2。,3、碳源物质的种类及微生物的利用,(1)有机碳化合物：,简单有机碳化合物：,复杂有机碳化合物：,(2)无机碳化合物,：,(3)特殊和有毒碳化合物：,(二)、氮源,1、定义：,凡是可以被微生物用来,构成细胞物质,的或代谢产物中,氮素来源,的营养物质。,2、功能,：蛋白质及其各类降解产物,N,源不足，菌体生长过慢；过多，微生物生长过旺而不利于产物的积累。,3、氮源物质的种类及微生物的利用,(1)有机氮化物：,简单有机氮化物：,氨基酸、蛋白胨等；,复杂有机氮化物：,蛋白质、核酸等。,(2)无机氮化物,：,铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐(少数微生物能利用)。,(3),分子态氮：,少数固氮微生物能利用，如固氮菌。,(三)、无机盐,(,inorganic salt),1、,定义：,无机盐是微生物生长必不可少的一类营养物质，,生理功能主要是,作为,酶活性中心,维持生物大分子和细胞结构的,稳定性,、,调节并维持细胞的,渗透压平衡,、,控制细胞的,氧化还原电位,作为某些微生物生长的,能源物质,等。,2、对无机盐的需要情况,大量元素,：,P、K、Mg、Ca、S、Na、(Fe)，,生长需要的浓度：10,-3,-10,-4,mol/L；,微量元素,：,Fe、B、Cu、Zn、Mo、Co、Mn，,生长需要的浓度：10,-6,-10,-8,mol/L(,培养基中含量)。,(四)、生长因子,(,growth factor),1、,定义：,生长因子通常指某些微生物生长所必需而且需要量很小，但,微生物自身不能合成或合成量不足,以满足机体生长需要的有机化合物。,不同微生物对生长因子的需要量和种类不同,。,2、,种类及功能：,生长因子分为,维生素,是作为酶的辅基或辅酶参与新陈代谢；,氨基酸:,有些微生物自身缺乏合成某些,氨基酸,的能力，,嘌呤与嘧啶,作用主要是作为酶的辅酶或辅基，,(五)、水,(1)细胞的,组成,成分,(2)细胞生化反应的,介质,；,(3)起,溶剂与运输介质,的作用，营养物质的吸收与代谢产物的分泌必须以水为介质才能完成；,(4)维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然,构象,；,(5)调节体细胞的,温度,；,(6)保持充足的水分是细胞维持自身正常形态的重要因素，即维持细胞内一定,膨压,；,第二节,微生物的营养类型,1、光能无机自养型：,也称,光能自养型,，能以,CO2,为唯一碳源或主要碳源并利用光能进行生长的的微生物，,使,CO,2,固定还原成细胞物质，并且伴随元素氧（硫）的释放。,藻类、蓝细菌和光合细菌属于这一类营养类型。,藻类和蓝细菌,与高等植物光合作用是一致的,2、光能有机营养型,或称,光能异养型，,不能以,CO2,作为唯一碳源或主要碳源，,需以有机物作为供氢体,，利用光能将,CO2,还原为细胞物质。,红螺属的一些细菌就是这一营养类型的代表,光能有机营养型细菌在生长时通常需要外源的生长因子。,3、化能无机自养型：,或称,化能自养型,，利用,无机物氧化过程中放出的化学能,作为它们生长所需的能量，以,CO2,或碳酸盐作为的唯一或主要碳源进行生长，,属于这类微生物的类群有硫化细菌、硝化细菌、氢细菌与铁细菌等,.,4、化能有机营养型：,或称,化能异养营养型,，生长所需的能量来自,有机物氧化,过程放出的化学能，有机物通常既是它们生长的碳源物质又是能源物质。,微生物营养类型(),依据,营养类型,特点,碳源,自养型(,autotrophs),以,CO2,为唯一或主要碳源,异养型(,heterotrophs),以有机物为碳源,能源,光能营养型(,phototrophs),以光为能源,化能营养型(,chemotrophs),以有机物氧化释放的化学能为能源,电子,供体,无机营养型(,lithotrophs),以还原性无机物为电子供体,有机营养型(,organotrophs),以有机物为电子供体,微生物的营养类型（）,营养类型,光能无机自养型,光能有机异养型,化能无机自养型,化能有机异养型,能源,光能,光能,化学能,化学能,主要碳源,CO2,CO2,CO2,有机物,大多数微生物属于,化能有机营养型,：绝大多数的细菌、全部真菌、原生动物以及病毒。,如果化能有机营养型微生物利用的有机物不具有生命活性，则,是,腐生型,；若是生活在生活细胞内从寄生体内获得营养物质，则是,寄生型,。,第三节 培养基,一、什么是培养基,培养基(,culture medium)：,是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。,培养基中应含满足微生物生长发育的：,水分、碳源、氮源、生长因子以及无机盐。,配制培养基的原则,一、选择适宜的营养物质,所有微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源，,培养细菌、放线菌、酵母菌、霉菌所需的培养基各不相同。,1.培养细菌：牛肉膏蛋白胨培养基(或简称普通肉汤培养基)，,2.培养放线菌：用高氏,I,号合成培养基，,3.培养酵母菌：一般用麦芽汁培养基，,4.培养霉菌：一般用查氏合成培养基。,二、营养物质浓度及配比合适,营养物质,浓度,过低,时不能满足微生物正常生长所需，,浓度过高,时则可能对微生物生长起抑制作用，,例如,高浓度,糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑菌或杀菌作用。,培养基中各营养物质之间的,浓度配比,也直接影响微生物的生长繁殖和(或)代谢产物的形成和积累，其中碳氮比(,C/N),的影响较大。,三、控制,pH,条件,各类微生物,生长繁殖或产生代谢产物的最适,pH,条件各不相同,。,细菌与放线菌适于在,pH77.5,范围内生长，酵母菌和霉菌通常在,pH4.56,范围内生长。,（如何控制生长过程中的,PH,值？）,pH,缓冲剂,维持培养基,pH,的相对恒定，通常在培养基中加入,pH,缓冲剂，,常用的缓冲剂,是,一氢和二氢磷酸盐(如,KH2PO4,和,K2HPO4),组成的混合物,。,K2HPO4,溶液呈碱性，,KH2PO4,溶液呈酸性，两种物质的等量混合溶液的,pH,为6.8。,KH,2,PO,4,和,K,2,HPO,4,缓冲剂的原理,当培养基中酸性物质积累导致,H+,浓度增加时，,H+,与弱碱性盐结合形成弱酸性化合物，培养基,pH,不会过度降低；如果培养基中,OH,-,浓度增加，,OH,-,则与弱酸性盐结合形成弱碱性化合物，培养基,pH,也不会过度升高。,但,KH,2,PO,4,和,K,2,HPO,4,缓冲系统只能在一定的,pH,范围(,pH6.47.2),内起调节作用,。,有些微生物，如乳酸菌能大量产酸，磷酸缓冲系统就难以起到缓冲作用，此时可在培养基中,添加难溶的碳酸盐(如,CaCO,3,),来进行调节,，,CaCO,3,难溶于水，不会使培养基,pH,过度升高，但它可以不断中和微生物产生的酸，同时释放出,CO,2,，,将培养基,pH,控制在一定范围内。,四、原料来源的选择,尽量利用,廉价且易于获得的原料,作为培养基成分，在发酵工业中，培养基用量很大，利用低成本的原料更体现出其经济价值。,五、灭菌处理,要获得微生物纯培养，必须避免杂菌污染，,对培养基一般采取高压蒸汽灭菌，一般培养基用1.05,kg/cm2，121.3,条件下维持1530,min,可达到灭菌目的。,灭菌,：采用物理或化学的方法杀死一定环境中的全部微生物。,消毒,：采用物理或化学的方法杀死一定环境中部份的部微生物。主要是病原微生物。,在高压蒸汽灭菌过程中，长时间高温会使某些,不耐热物质遭到破坏,，如使糖类物质形成氨基糖、焦糖，,长时间高温还会,引起磷酸盐、碳酸盐与某些阳离子(特别是钙、镁、铁离子)结合形成难溶性复合物而产生沉淀，,高压蒸汽灭菌后，,培养基,pH,会发生改变(一般使,pH,降低0.2)，,灭菌的方法,(1)物理法,加热法,：,.干热灭菌,灼烧灭菌,：利用火焰直接把微生物烧灭。如：接种工具，玻璃瓶口等。,干燥热空气灭菌,(常称,干热灭菌,)：把待灭菌的物品均匀地放在电热恒温干燥箱内，加热至,160-170，持续2,hr,。,如：玻璃器皿(吸管、平板等)、金属用具等；但培养基、塑料制品、橡胶制品等不能用此法。,湿热灭菌,：,高压蒸汽灭菌,：,121，30,min,。,灭菌器主要有卧式、立式、手提式(实验室最为常用)。是一种最有效、使用最广泛的灭菌方法。,常压蒸汽灭菌：间歇(分段)灭菌,：,100，30,min,，,杀死一切细菌的营养体，但不能杀死芽孢，,每天进行1次，连续3天；,在两次灭菌间隙，灭菌物应放在室温(20-30)条件下恒温培养，使芽孢萌发为营养体，第二次灭菌即可杀死；经过两次培养3次反复灭菌，即可达完全灭菌。,持续灭菌,：常压蒸汽持续灭菌中，从蒸汽大量产生开始，继续加大火力保持充足蒸汽，持续加热3-6,hr，,杀死绝大部分芽孢和全部营养体，达到灭菌目的。,比较：,在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。,因为,：,湿热 情况下，菌体吸水，使蛋白质易于凝固；,湿热的穿透力更强；,蒸汽与被灭菌物接触冷凝成水时，放出热量，使其温度迅速升高，从而增强了杀菌能力。,煮沸消毒法,物品在清水中煮沸5,min,以上，可杀死附在物品上的微生物细胞及部份芽孢。如果延长煮沸时间，或在水中加入1%碳酸钠或2-5%石碳酸，则效果会更好。本法适于毛巾衣物、注射器、解剖用具等的消毒。,巴斯德消毒法,：,63，30,min；,或70，15,min。,一般用于牛奶、啤酒等的消毒，可保持物品原有的营养风味。,过滤除菌：,含菌液体或气体通过细菌过滤器，使杂菌留在滤器或滤板上，而支除杂菌。,射线除菌,：,紫外线穿透力弱，一薄层普通玻璃或水，均能滤除大量紫外线。一般适用于表面灭菌或空气灭菌，如：实验室、接种室、接种箱等。,(2)化学法：,主要是利用有机或无机的化学药品以实验室用具和其它物体表面进行灭菌与消毒(,不能杀死芽孢，起消毒作用),。,机理：能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂。实验室常用有：,升汞、甲醛、高锰酸钾、乙醇、碘酒、石碳酸、漂白粉,等。,在配制培养基过程中，,泡沫,的存在对灭菌处理有何影响？,三、培养基的类型以及应用,(一)按成分不同划分,天然培养基,(,complex medium)：,。,合成培养基,(,synthetic medium),半合成培养基：,天然培养基(,complex medium,),：,凡是利用来自生物的组织、器官以用它们的抽提物或制品制成的培养基。如：牛肉汁、玉米粉、米糠。,其化学成分还不清楚或化学成分不恒定，也称化学限定培养基。,如：牛肉膏蛋白胨培养基等。,合成培养基,(,synthetic medium),是由化学成分完全了解的物质(化学药品)配制而成的培养基。也称化学限定培养基。如：高氏一号培养基等。,半合成培养基,采用天然有机物作为,N,源和生长物质，再添加一部分的化学药品作为,C,源和无机盐来源的培养基。,二）根据物理状态划分,液体培养基：,根据配方溶于定量的水制成。,固体培养基：,在液体培养基中，添加凝固剂。常用的凝固剂有琼脂(或称洋菜、冻粉)、明胶、硅酸钠等，以琼脂最为常见。,固体材料可看作是一种不加凝固剂的固体培养基。,半固体培养基：,一般在液体培养基中加入,2-5,琼脂即成。,琼脂,琼脂：,成分主要是多糖类物质(琼脂糖约70%，琼脂果胶约30%)，其化学性质稳定，一般微生物不能分解，故用作凝固剂不引起化学成分的变化；,在95以上的热水中开始由凝胶融化为溶胶，冷却至45以下开始重新凝固，反复多次性质不变；用量：15-20。,明胶,明胶：,化学成分是动物蛋白质。一般在25以上即融化，22以下凝固，所以不能作为常用的凝固剂,少数微生物能分解利用使之液化，于是多用于,穿刺培养,；用量：10%-20%或更多。,(三)按用途划分,基础培养基,(,minimum medium),加富培养基,(,enrichment medium),鉴别培养基,(,differential medium),选择培养基,(,selectivemedium),基础培养基,(,minimum medium),基础培养基,(,minimum medium),是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。如：细菌牛肉膏蛋白胨；酵母菌麦芽汁；真菌马铃薯蔗糖培养基。,加富培养基,(,enrichment medium),加富培养基,(,enrichment medium),也称增殖培养基，加入,特殊营养物质,，,使这类微生物增殖速度比其它微生物快,。,这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。,鉴别培养基,(,differential medium),鉴别培养基,(,differential medium),加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这种,代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应,.,选择培养基,(,selectivemedium),选择培养基,(,selectivemedium),将某种微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。,依据某些微生物的,特殊营养,需求设计的。,加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以,抑制或杀死其他微生物,。,例1：,培养基中加入适量的青霉素或链霉素，可抑制细菌和放线菌的生长，从而将真菌和酵母菌分离出来；,例2：,在马丁氏培养基中加入一定量的孟加拉红染料、链霉素能较好地选择培养真菌；,例3：,YEM(,甘露醇酵母粉培养基)加刚果红或结晶紫可抑制,G+,细菌的生长。,第四节 微生物的产能代谢,一、代谢的类型,代谢,(,metabolism),是细胞内发生的各种化学反应的总称，由两个过程组成。,1,分解代谢,是指细胞将大分子物质降解成小分子物质，并在这个过程中产生能量。,2,合成代谢,是指细胞利用简单的小分子物质合成复杂大分子的过程,，在这个过程中要消耗能量。,分解代谢分为三个阶段,第一阶段,是将蛋白质、多糖及脂类等大分子营养物质,降解成,氨基酸、单糖及脂肪酸等,小分子物质；,第二阶段,是将第一阶段产物进一步,降解成更为简单的乙酰辅酶,A、,丙酮酸以及能进入三羧酸,循环的某些中间产物，在这个阶段会产生一些,ATP、NADH,及,FADH2；,第三阶段,是通过三羧酸循环将第二阶段产物,完全降解生成,CO2，,并产生,ATP,、NADH,及,FADH2。,分解代谢和合成代谢的关系,合成代谢所利用的小分子物质源于分解代谢过程中产生的中间产物。,二、生物氧化,生物氧化:,物质在生物体内经过一系列连续的氧化还原反应，逐步分解并释放能量的过程，称为生物氧化，,是一个产能代谢过程。即分解代谢过程。,1,、生物氧化的含义及形式,生物氧化是指有机分子在机体内氧化分解成,CO2,和,H2O,并释放出能量的过程。,其形式包括底物与氧结合、脱氢或失去电子,3,种；,其过程可分脱氢（或电子）、,递氢（或电子）,受氢（或电子）,3,个阶段。,根据递氢特别是受氢过程中氢受体性质的不同，可以把生物氧化区分成,有氧呼吸、无氧呼吸和发酵,3,种类型。,2,、无氧呼吸,无氧呼吸又称厌氧呼吸，是一类呼吸链末端的氢受体为外源无机氧化物（个别为有机氧化物）的生物氧化,。,3,、发酵,在生物氧化或能量代谢中，,发酵是指在无氧条件下，底物脱氧后所产生的还原力,H,不经过呼吸链传递而直接交给某一内源氧化性中间代谢产物,的一类低效产能反应。,（一）异养微生物的主要产能方式,异养微生物氧化有机物的方式，根据氧化还原反应中电子受体的不同可分成,发酵,呼吸有氧呼吸,无氧呼吸,1、己糖的分解（糖酵解）,生物体内葡萄糖被降解成丙酮酸的过程称为糖酵解(,glycolysis)，,主要分为四种途径：,EMP,途径、,HMP,途径、,ED,途径、,磷酸解酮酶途径。,其中,EMP,途径是最一般，是生物界所共有的,，在微生物中广泛存在于许多好氧菌、兼性厌氧菌和厌氧菌中。,EMP,途径(糖酵解途径),第一阶段：生成两分子的主要中间代谢产物：甘油醛-3-磷酸。,第二阶段发生氧化还原反应，合成,ATP,并形成两分子的丙酮酸。,EMP,途径可为微生物的生理活动提供,ATP,和,NADH，,其中间产物又可为微生物的合成代谢提供碳骨架。,HMP,途径（磷酸戊糖途径，单磷酸己糖途径）,磷酸戊糖途径可分为氧化阶段和非氧化阶段。一个,HMP,途径循环的结果为：,一般认为,HMP,途径不是产能途径，而是为生物合成,提供大量的还原力(,NADPH),和中间代谢产物。,ED,途径,一分子葡萄糖经,ED,途径最后生成两分了丙酮酸、一分子,ATP、,分子,NADH,和,NADH。,ED,途径可不依赖于,EMP,和,HMP,途径而单独存在，但对于靠底物水平磷酸化获得,ATP,的厌氧菌而言，,ED,途径不如,EMP,途径经济。,磷酸解酮酶途径,磷酸解酮酶途径是,明串珠菌在进行异型乳酸发酵过程中分解己糖和戊糖的途径,。该途径的特征性酶是磷酸解酮酶，根据解酮酶的不同，把具有磷酸戊糖解酮酶的称为,PK,途径，把具有磷酸己糖解酮酶的叫,HK,途径。,2、丙酮酸代谢的多样性,（1）发酵,发酵(,fermentation),是指微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某种中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物,。,(在发酵条件下有机化合物只是部分地被氧化，因此，只释放出一小部分的能量。）,发酵产能是厌氧和兼性好氧菌获取能量的主要方式。,发酵的种类有很多，可发酵的底物有糖类、有机酸、氨基酸等，其中以微生物发酵葡萄糖最为重要。,微生物发酵葡萄糖的形式,乙醇发酵,乳酸发酵,丙酸发酵,丁酸发酵,混合酸发酵,先通过,EMP,途径将葡萄糖分解为丙酮酸，然后由不同的酶系将丙酮酸转化成,不同的产物,，如乳酸、乙酸、甲酸、乙醇、,CO2,和氢气，,2)呼吸作用,微生物在降解底物的过程中，将释放出的电子交给,NAD(P)+、FAD,或,FMN,等电子载体，再经电子传递系统传给外源电子受体，从而生成水或他还原型产物并释放出能量的过程，称为,呼吸作用,。,、有氧呼吸,在呼吸作用中，以,分子氧,作为最终电子受体的称为有氧呼吸(,aerobic respiration)。,在发酵过程中，葡萄糖经过糖酵解作用形成的丙酮酸在厌氧条件下转变成不同的发酵产物，,而在有氧呼吸过程中，丙酮酸进入三羧酸循环(,tricarboxylic acid cycle，,简称,TCA,循环)，被彻底氧化生成,CO2,和水，同时释放大量能量。,II,无氧呼吸,(,anaerobic respiration)：,无氧呼吸的最终电子受体不是氧，而是像,NO,3,-、NO,2,-、SO,4,2,-、CO,2,等这类外源受体。,无氧呼吸也需要细胞色素等电子传递体，并在能量分级释放过程中伴随有磷酸化作用，生成的能量不如有氧呼吸产生的多。,反硝化作用,（硝酸盐呼吸或脱氮作用）：指反硝化细菌（兼性厌氧微生物）以硝酸盐作为最终电子受体，,NO3-,还原成,NO2-、N2O、N2,等的过程（通常称脱,N,作用）,产生的条件：,厌氧、有机质、硝酸盐；,在农业和环境中的应用,：,不利,：,N,素损失，污染环境；,有利,：可消除水域中,N,素的富集；,反硫化作用（硫酸盐呼吸）,反硫化细菌（严格厌氧菌，多数属兼性营养型）以,SO,4,2,-,为最终电子受体，使,SO,4,2,-,还原成,H,2,S,的无氧呼吸类型,沼气发酵（甲烷形成）,产甲烷细菌在厌氧条件下，利用,H2,还原,CO2,等碳源营养物以产生细胞物质、能量和代谢废物,CH,4,的过程。类经,CO2,或重碳酸盐作为呼吸链末端,H,受体的无氧呼吸。,产甲烷细菌,：是一些,专性厌氧菌，,古生菌。,（二）化能自养微生物产能代谢,一些微生物可以从氧化无机物获得能量，同化合成细胞物质，这类细菌称为,化能自养微生物,。它们在无机能源氧化过程中通过,氧化磷酸化,产生,ATP。,氨的氧化（硝化作用）,硫的氧化（硫化作用）,铁的氧化,氢的氧化,（三）光能营养微生物的产能方式,光能微生物不论是自养型还是异养型都具有光合色素，它们象绿色植物一样可,将光能转换为化学能(,ATP)，,这种能量的转化方式称为,光合磷酸化作用,。如植物、藻类、蓝细菌、光合细菌、嗜盐菌等。,三、能量转换,在产能代谢过程：,底物水平磷酸化,氧化磷酸化,光合磷酸化,1、底物水平磷酸化(,substratelevelphosphorylation),物质在生物氧化过程中，生成一些含有高能键的化合物，这些化合物直接偶联,ATP,或,GTP,的合成，这种产生,ATP,等高能分子的方式称为,底物水平磷酸化。,底物水平磷酸化既存在于发酵过程中，也存在于呼吸作用过程中。,2、氧化磷酸化(,oxidative phosphorylation),物质在生物氧化过程中形成的,NADH,和,FADH2,可通过位于线粒体内膜和细菌质膜上的电子传递系统将电子传递给氧或其他氧化型物质，在这个过程中偶联着,ATP,的合成，这种产生,ATP,的方式称为,氧化磷酸化,。一分子,NADH,和,FADH2,可分别产生3个和2个,ATP。,3、光合磷酸化(,photophosphorylation),光合磷酸化是将光能转变成化学能，,以用于从,CO2,合成细胞物质。行光合作用的生物体除了绿色植物外，还包括光合微生物，如藻类、蓝细菌和光合细菌(包括紫色细菌、绿色细菌、嗜盐菌等)。,第四章 微生物的生长和环境条件,第一节 微生物的分离和纯培养,一、获得纯培养的方法,纯培养,：从一个细胞或同一个细胞群繁殖得到的子代，称纯培养或纯种。,纯培养的类型：菌种纯（菌落纯）,-是分离菌落而得到的；,菌株纯（细胞纯）：,是分离单个细胞得到的。,（一）用固体培养基分离纯培养,稀释倒平板法,(,pour plate method)（,混菌法）：,菌落纯,涂布平板法,(,spread platemethod),平板划线分离法,(,streak plate method),稀释摇管法,(,dilutlon shake culture method),稀释法有一个重要缺点，它只能分离出混杂微生物群体中,占数量优势的种类,接种和分离工具,1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀,斜面接种时的无菌操作,倾注平板法（,a）,涂布平板法（,b）,图解,1.菌悬液 2.熔化的培养基 3.培养物 4.无菌水,平板划线分离法,1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法,（二）用液体培养基分离纯培养,细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，这些微生物仍需,要用液体培养基,分离来获得纯培养。,（三）单细胞(单孢子)分离,采取显微分离法从混杂群体中直接,分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养,，称为,单细胞(单孢子)分离法,。,（四）选择培养分离,