生物检测技术——PCR技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物检测技术 PCR技术,聚合酶链反应,(Polymerase Chain Reaction,PCR),，体外核酸扩增技术。,能在一个试管内将所要研究微量的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。,PCR,使人们能通过试管内的数小时的反应将特定的DNA片段扩增数百万倍。该技术已成为分子生物学研究的重要技术体系，其建立极大地推动了生命科学的研究进展。在DNA重组与表达、基因结构分析与功能检测具有重要的应用价值。,PCR技术的创建,Kary B.Mullis（穆利斯（美）,Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,扩增DNA的设想。,1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。,1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖,。,PCR技术的原理,PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，反应原理与细胞内的DNA复制相似，但PCR的反应体系要简单的多，主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3末端互补的合成引物、四种dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。基本过程是以拟扩增的DNA分子为模板，首先高温变性，将混合物加热到94维持l5到3O秒，使模板DNA双链解旋成两条单链；然后逐渐降温退火，温度降到55，使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；最后在引物、DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。如此循环20次原始DNA将扩增约l0的六次方倍。经过扩增后的DNA产物多为介于引物与原始DNA想结合的位点之间的片段。,PCR原理图,三磷酸脱氧核苷酸：四种三磷酸脱氧核苷酸(dATP，dTTP，dGTP，dCTP)是PCR反应的原料。四种各dNTP分子浓度必须相等，以减少错配。,耐热DNA聚合酶：耐热DNA聚合酶的发现，实现了PCR的自动化，能经受95 以上的高温而不失活。,其他成分：二价Mg离子能活化DNA聚合酶；DMSO有利于DNA的变性；TMAC可去除非特异扩增，促进PCR；甘油有利于DNA复性，不过并不是对所有的PCR都有利。,PCR反应条件优化选择,首先是PCR反应循环阶段的优化选择：变性的温度和时间的控制，一般在第一轮循环前先进行94预变性3l0min，以便使模板D N A完全解链，然后加入TaqDNA聚合酶趁热启动，这样可减少聚合酶在低温下仍有活性而引起的非特异性扩增；退火温度的控制，一般来说，退火温度越高，所得产物的特异性越高，但也不能太高，否则会影响引物与模板的碱基配对；延伸的温度和时间控制，一般延伸的温度设定在所用DNA聚合酶的最适温度附近，若不合适的温度，不仅影响产物的特异性，也会影响产量；延伸时间不宜过长，否则会导致非特异性产物扩增带的出现。,然后是PCR反应成分的优化选择：模板核酸首先必须纯化，除去蛋白酶等杂质，浓度因反应不同而有所选择；引物首先要质量高，需纯化，引物设计要合理；反应缓冲系统中常加入KCl而有利于退火，对于不同PCR反应，缓冲条件亦有所不同；三磷酸脱氧核苷酸的浓度应适宜，过高可加快反应速度，但同时也增加了碱基错配率，反之可提高反应的特异性；耐热聚合酶的浓度也应适宜，过少会影响靶序列扩增产量，过的会导致非特异性的扩增。,最后是采用热启动的方法使耐热DNA聚合酶仅在反应体系到较高的温度是才发挥作用，消除非特异性的扩增，提高PCR反应的特异性和敏感性。,PCR产物的检测,PCR反应进行完了之后，必须对其产物进行检测才能判定此反应产物是否为特异性扩增，结果是否准确可靠。目前发展了很多PCR产物检测方法，常用的方法有：1)凝胶电泳分析法，将产物进行电泳，常用溴乙锭染色，根据在紫外光下发出的荧光确定片段在凝胶中的位置，并以此来判断扩增片段的大小。2)Southern印迹杂交法，在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。3)核酸序列分析法，对PCR产物直接进行测序，是PCR产物分析最精确的方法，但也是最为繁琐的方法。,PCR仪器,梯度PCR仪 PCR荧光分析系统,PCR技术的应用,一 这里仅以结核杆菌为例，说明PCR技术在病原生物检测中的应,用。,结核杆菌标本的采集：根据病变部位不同，可采集痰、胸腹水、尿尿液、脑脊液、分泌物等。模板的制备：向痰液中加入l倍体积4Na0H混匀，室温放置30min，取液化痰lmL，12000rmin离心5min，弃上清液，沉淀物再次悬浮于lmL无菌盐水中，混匀后再次离心弃上清液。胸腹水、脑脊液等体液标本，取5001000,L12000rmin离心5min，弃上清液，加入5,L 裂解液重悬浮沉淀物，95水浴20min，12000rmin离心5min，取上清液做模板。扩增、电泳、结果观察同上。由于结核杆菌成分复杂，易污染，PCR操作应严格分区进行。应用PCR进行结核杆菌DNA鉴定，每毫升中有几个细菌即可获得阳性结果，有利于结核病的早期诊断，尤其是结核病患者经药物治疗或体内出现细胞壁缺损的L型细菌后，检测结果仍不受影响。,二PCR 技术在食品微生物检测中的应用,（1,）,啤酒腐败菌的鉴定,：众所周知，啤酒花中的异a 酸对大多数革兰氏阳性菌有一定的抑菌作用，但是有一些乳酸菌，特别是乳杆菌对异a 酸有抗性，可以在含酒花物质的啤酒中生长，从而造成啤酒的腐败。从抗酒花菌株短乳杆菌ABBC45 的质粒上鉴定得到抗酒花基因horA。，凡是能引起啤酒腐败的乳杆菌，均含有似horA基因，这证明了horA基因与酒花抗性有关。根据horA 的部分基因顺序人工合成2 段特异性引物，使用TaqDNA 聚合酶，从一系列乳杆菌中提取DNA溶液，加人含特异性引物的反应混合物中，进人热循环，最终的反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测。研究者通过检测微生物中的似horA基因的存在与否来预言其对啤酒的腐败特性。horAPCR技术对腐败菌的检测大约需要6h左右，比基于生长现象的传统平板培养方法要快捷得多，因此受到各国广泛应用。,2）乳酸细菌的检测和鉴定：以双歧杆菌为例,比较双歧杆菌现有的32 个种及相关种的16SrRNA基因序列后，发现在其1414 一1432位的寡核昔酸碱基序列(21个)，在所有的双歧杆菌中相同，能作为双歧杆菌属特异的寡核昔酸片断，可用其作为PCR 的引物来扩增双歧杆菌16SrRNA 的基因片断。而模板DNA通过简单的SDS裂解菌体细胞，而后用蛋白酶K去除蛋白即可获得。在此条件下，所有的双歧杆菌可由PCR 扩增产生典型的1.35kb 的核苷酸片断，而其它细菌则不能产生此带，故用PCR技术能够进行乳酸菌的检测、鉴定及分类。,3）食品样品中致病菌的检测,利用PCR检测食品中的致病菌，首先要抽提靶DNA，通过离心或过滤的方法可从样品中获得细菌细胞，然后将细胞裂解，进行核酸纯化，使其适合作PCR。也可以直接裂解样品中的细菌细胞，抽提核酸。沙门氏菌、变形弧菌、大肠杆菌、0157:H7 等多种致病菌都有用PCR方法检测的报道，这些研究成果都表明PCR方法较传统方法快速、灵敏、特异性强。,三 应用PCR技术检测环境中的微生物,在众多的污染物中，生物污染(病原菌、病毒及其它一些有害生物)直接威胁着人类的健康。传统的检测方法需要对样品进行分离培养，往往要花上几天乃至数周的时间，而且有些致病菌或病毒难以人工培养，给检测带来困难，而PCR技术的应用，克服了上述不足。,利用PCR技术直接从海水DNA样品中特异性地扩增一种目前常规方法无法培养的Trichodesmium thiebautii菌株的固氮基因(nif)片断。,用PCR检测Ecoli可以在24 h内完成对99种不同的环境水样的检测，取得了与标准方法100相吻合的结果。,四 应用PCR技术检测环境中的致病菌和指示菌,根据病原菌特定的遗传因子，应用PCR技术可检测土壤、水体和大气等环境中的致病菌。肠出血性大肠杆菌0157是引起出血性大肠炎、溶血性尿毒症的一类大肠菌，由于其携带有Vero毒素遗传因子，通过PCR，即使反应物中只有10个菌存在也可将其迅速检出。几乎所有的沙门氏菌都具有侵入性相关遗传因子rivA，以此遗传因子设计引物，就可以高灵敏度地检出沙门氏菌。,PCR技术的前景,近年来，PCR技术已广泛应用于医学、环境微生物检测中，并展示了广阔的应用前景。随着PCR技术本身的不断发展和完善以及饲料中的应用微生物如益生菌、EM(有益微生物)、基因工程菌的研究成为热点，PCR技术在微生物的检测中也将发挥愈来愈大的作用。,PCR 技术的应用给食品微生物的检测带来了极大的方便，尽管还存在一些问题，但是，随着科学技术的发展以及科研工作者的不懈努力，这些问题都会得到解决，相信不久的将来，PCR技术的应用回更加广泛。,谢谢,