高效液相色谱法及超临界流体色谱法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,高效液相色谱法及超临界流体色谱法,第十章 高效液相色谱法及超临界流体色谱法,10.1,概述,10.2,高效液相色谱法的基本原理,10.3,高效液相色谱法的类型,10.4,高效液相色谱仪,10.5,超临界流体色谱法,10.6,实验技术,2,概述,HPLC,high velocity,high resolution,and high sensitivity,H,igh-,P,erformance,L,iquid Chromatography,H,igh-,P,ressure,L,iquid Chromatography,H,igh-,P,rice,L,iquid Chromatography,3,4,5,10.2 HPLC,的基本原理,GC,的基本理论、基本概念适用于,HPLC。,液相色谱的,van Deemter,方程,6,涡流扩散项,纵向扩散项,传质阻抗项,板高,H,越小，分离效率越高。可以从色谱柱、流动相、及流速等方面,综合考虑，,提高,HPLC,的柱效的措施,采用颗粒小而均匀的填料，填充均匀；,采用表面多孔的填料，减小填料的孔隙深度；,流动相采用小分子溶剂，减小粘度,(,H,2,O、ACN、MeOH)；,适当提高柱温，增大,D,m,；,采用一定的流动相流速,u,(,一般,1,mL/min,),7,柱外效应,：柱前峰展宽柱后峰展宽,柱前峰展宽进样及进样器到色谱柱连接管引起,柱前后展宽检测器流通池和连接管引起,10.3 HPLC,的类型,I,液液分配色谱法,Liquid,Liquid Partition Chromatography,LLPC,固定相与流动相均为液体,(,互不相溶,),；,基本原理,：组分在固定相和流动相上的不同分配而实现分离；,固定相,：早期涂渍固定液，容易流失，现较少采用；,化学键合固定相,：将,各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。,8,（1）,寿命长,，,固定液不易流失，柱稳定性高；,（2）,传质快,，,表面均一，无深凹陷，比一般液体固定相传质快；,（4）,选择性好,，,可键合不同基团改变其选择性；,（5）耐受各种溶剂，,有利于梯度洗脱；,流动相类别,流动相,按极性分：,极性(乙腈、甲醇、水,)；,弱极性(氯仿、乙酸乙酯)；,非极性(己烷)；,9,正相色谱法,反向色谱法,采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,II,液固吸附色谱法,Liquid Solid Absorption Chromatography,LSAC,10,固定相：固体吸附剂（硅胶）,基本原理,：根据组分在固定相上的吸附作用的不同进行分离；,样品分子(,X,),被流动相带入柱内，与流动相分子(,S,),在吸附剂的表面发生竞争性的吸附作用.,吸附平衡常数,K,越大，保留值越大。,LASC,中，流动相：烷烃为底剂的二元或多元溶剂，,己烷乙酸乙酯；己烷氯仿,III,离子交换色谱法,Ion Exchange Chromatography,IEC,K,越大，离子交换能力越强，固定相对被分析离子的保留越强；,分析对象：离子(各种无机阴阳离子,)：,SO,4,2+,、NO,3,、Cl,、Na,、Mg,等,有机酸碱、氨基酸,11,固定相,：离子交换树脂(,聚苯乙烯和二乙烯基的交联聚合物，硅胶键合离子交换剂,),流动相,：含有反离子的水溶液(柠檬酸根离子、,CO,3,、F,),基本原理,：样品中离子与离子交换树脂的交换能力的不同进行分离；,12,13,IV,离子对色谱法,Ion Pair Chromatography,IPC,固定相：,C18/C8,上涂渍或在流动相中加入与溶质分子电荷相反 的离子对试剂,流动相,：有机溶剂(甲醇/乙腈水)加入离子对试剂,离子对试剂,：,烷基铵类：,(C,4,H,9,),4,N,+,OH,-,、,C,16,H,33,(CH,3,),3,N,+,OH,-,(,分析,X,),烷基磺酸类,：,己烷磺酸钠,C,6,H,13,SO,3,Na (,分析,X,),基本原理,：,根据形成的离子对化合物在两相间分配不同而分离。,14,生成的离子对与固定相的亲和力越大，保留越强，出峰越后。,分析对象：有机酸、有机碱等,Column：IonPac NS1、NG1,Eluent：2 mM TBAOH,24%,48%ACN in 10 min,Flow rate：1.0 mL/min,Detection：Conductivity (suppressor type),Regenerator：10 mN H,2,SO,4,1.Methanesulfonic acid 5.0 g/mL(ppm),4.1-Hexanesulfonic acid 8.8,5.1-Heptanesulfonic acid 8.9,6.1-Octanesulfonic acid 8.9,0,Retention time(min),12,16,8,S,4,1,6,2,3,4,5,7,反相离子对,色谱,分离,有机酸,V,离子色谱法,Ion Chromatography,IC,固定相,：离子交换树脂,流动相,：电解质溶液（高电导）,分离原理,：同,IEC，,离子交换后的洗脱液进入抑制柱后进行电导检测,特点,：抑制柱将样品离子转变成相应的酸、碱增加电导，将洗脱液变,成低电导成分降低背景干扰。,16,分析对象：无机、有机阴阳离子、糖类、氨基酸等,抑制器的作用,废,液,Back Ground,：Na,2,CO,3,/NaHCO,3,(700S),NaF,NaCl,NaNO,3,Na,2,HPO,4,Na,2,SO,4,Retention time,Conductivity,NaF,NaCl,NaNO,3,Na,2,HPO,4,Na,2,SO,4,Back Ground,：Na,2,CO,3,/NaHCO,3,(700S),Retention time,Conductivity,HF,HCl,HNO,3,H,3,PO,4,H,2,SO,4,Retention time,Back Ground,：H,2,CO,3,(15S),Conductivity,17,抑制器,安装在电导池之前,提高待测离子的电导率,：,Na,+,Cl,-,H,+,Cl,-,提高灵敏度,降低背景电导(淋洗液),:,Na,+,HCO,3,-,H,2,CO,3,减少噪音,Na,+,OH,-,H,2,O,18,Y,+,Na,+,抑制器的工作原理(阴离子),X,-,:,样品中的阴离子,Y,+,:,样品中的阳离子,H,2,O,H,2,O,OH,-,Na,+,Y,+,H,2,O Na,+,Y,+,X,-,Na,+,CO,3,2,-,(,样品,淋洗液,),H,+,H,+,+CO,3,2-,H,+,+,X,-,至检测器,H,2,CO,3,H,+,X,-,H,+,+O,2,H,2,O,H,2,+OH,-,H,2,O,Na,+,OH,-,H,2,H,2,O,O,2,废,液,废液,电极 （）,电极 （）,纯水或来自检,测器的流体,H,+,H,+,H,+,H,+,阳离子交换膜,阳离子交换膜,19,H,2,O,H,2,O,H,+,+O,2,H,2,O,H,2,+OH,-,H,2,O,废液/气体,废液,H,2,O SO,4,2-,Y,+,X,-,H,+,MSA,-,(,样品,e,淋洗液）,OH,-,OH,-,MSA,-,SO,4,2-,X,-,OH,-,MSA,-,SO,4,2-,X,-,H,+,MSA,-,O,2,H,2,O,H,2,H,+,+OH,-,Y,+,+OH,-,H,+,抑制器的工作原理(阳离子),至,检测器,H,2,O,Y,+,OH,-,X,-,:,样品中的阴离子,Y,+,:,样品中的阳离子,电极 （）,电极 （）,阴离子交换膜,阴离子交换膜,纯水或来自检测器的液体,20,20,VI,空间排阻色谱法,Size Exclusion Chromatography,SEC,22,固定相,：多孔性凝胶,流动相,：水溶液或有机溶液,分离原理,：,分离组分的分子尺寸,凝胶的孔径大小,(,葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶),动画,特点,：,体积大的分子完全被排阻洗脱下来,体积小的分子最后的被洗脱下来,分析对象,：,高聚物，生物大分子（蛋白、核酸）,VII,亲和色谱法,Affinity Chromatography,AC,固定相,：固定相表面键合特异性配基,流动相,：类似,LLPC（,乙腈/甲醇、水等）,分离原理,：根据固定相对溶质的特异性吸附而分离,分离过程：一般流动相携带试样 亲和物与配基结合,强洗脱能力的流动相 洗脱亲和物（大分子）,23,分离对象：,酶与基质（或抑制剂）,抗原与抗体,激素与受体,外源凝集素与核酸的碱基对,10.4,高效液相色谱仪,24,仪器特点：,高压、高效、高速,分离对象,：,生物大分子、天然产物、高分子化合物、大多数高沸点有机化合物,工作过程：,高压输液系统,核心部件：,高压泵,压力范围：30,50,KPa。,为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（,7,不够,灵敏。,33,原理,：,利用待测物流入反应池时在工作电极表明发生氧化还原反应，两电极间有电流通过，电流大小与待测物质浓度成正比。,要点：,具有电活性物质,分离过程：一般流动相携带试样 亲和物与配基结合,(葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶),气体的低黏度，传质阻力小，可以快速高效的分离；,梯度洗脱：在一个分析周期内，按一定的程序连续的改变流动相中溶剂的组成和配比，使样品中的各个组分都能在适宜的条件下得到分离,固定相：早期涂渍固定液，容易流失，现较少采用；,荧光衍生化试剂（丹磺酸酰氯、丹磺酸酰阱、荧光胺、OPA等）,(葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶),色谱柱：毛细管柱(10 cm 63 m i.,无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解,体积大的分子完全被排阻洗脱下来,吸附平衡常数 K 越大，保留值越大。,V 离子色谱法 Ion Chromatography,IC,5.,降低背景电导(淋洗液):,与HPLC差别：,特点：抑制柱将样品离子转变成相应的酸、碱增加电导，将洗脱液变,线性梯度淋洗，2%/min,示差折光检测器,differential refractive index detector,原理：,样品组分的折射率与流动相折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。,要点,：,灵敏度低，不能用于梯度洗脱,34,蒸发光散射检测器,evaporative light-scattering detector,ELSD,35,流出液,雾化器雾化,加热漂移管加热,溶剂蒸发,激光束照在溶质颗粒,产生光散射,散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关。,要点,：,通用型质量检测器，,可用于梯度洗脱,分析对象,：适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测,10.5,超临界流体色谱,supercritical fluid chromatography,SFC,36,定义,：以超临界流体为流动相的色谱分析法，具有,GC,和,HPLC,的优点，适于分析,GC,不能分析的高沸点、低挥发性的试样。,超临界流体,：,在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。,超临界流体既不是气体，也不是液体，而是一种介于二者之间的一种对分离很有利的流体。,超临界流体的特性,37,1）性质介于液体和气体之间；,气体,的,低黏度,，传质阻力小，可以快速高效的分离；,液体,的,高密度,，适于低温下分离热不稳定、分子量大的物质；,SFC,的扩散系数、粘度和溶解力都是密度的函数，可通过,改变,SFC,的密度调节组分分离,，超临界流体的密度与压力有关。,传质阻力小,适于低温,SFC,的固定相和流动相,38,SFC,色谱柱,：,填充柱,：颗粒,d,p,:,3,10,m,L,col,:,25 cm,固定液膜厚：几,mm,交联毛细管柱,：颗粒,d,f,:,0.05,1 m,L,col,:,10 20 cm,固定液膜厚0.05,1 m,SFC,的固定相,：,固体吸附剂（硅胶）；键合到毛细管壁上的高聚物,要点：,CO,2,应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解,性好，在紫外光区无吸收；,缺点,：极性太弱；加少量甲醇等改性；,SFC,的流动相,：,超临界流体色谱仪器,39,与,HPLC,差别：,HPLC,只在柱入口加压，而,SFC,整个都处于高压下，使流动相处于高密度状态；,SFC,必须装有毛细管限流器，以实现限流器两端相的转变,高压泵,无脉冲的注射泵，通过电子压力传感器和流量检测器，计算,机控制流动相的密度和流量；,检测器,可采用,HPLC,的检测器(,UV,FL)，,也可采用,GC,的,FID,检测器.,SFC,中的压力控制,40,压力效应,：,在,SFC,中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。,CO,2,流动相，当压力改变：7.0 9.010,6,Pa，,则：,C,16,H,34,的保留时间：25,5 min。,程序升压,SFC,的应用,I,聚苯醚低聚物的,SFC,分析,色谱柱：毛细管柱(10,cm,63,m i.d.),固定相：键合二甲基聚硅氧烷；,流动相：,CO,2,；,柱温：120,C,；,程序升压；,SFC,既可分析,GC,中不适用的,高沸点、低挥发性样品,和,HPLC,中缺少检测功能团的样品，它又比,HPLC,有更高的柱效和更快的分析速度。,分析对象,：天然产物、高聚物、表面活性剂等。,SFC,的发展现状,43,SFC,的三次起落：,1960,s,的先驱性研究；,1980,s,初形成浪潮，认为会掀起分析方法的革命；,目前，大公司纷纷撤去,SFC,分离设备，放弃进一步发展的计划。,缺点,：,a.,整个体系都要在高压下进行；,b.,流动相的选择有限(,CO,2,)；,c.,仪器制造复杂，昂贵；,G.Guiochon(American Lab 1998,(9),1415),指出,成功和普及并成为定量分析方法必须具备：,易于使用，操作费用低，,能够得到准确，可重复的定量结果，,要能够解决至少一个分析化学中的重要问题.,如，1960,s,的,GC,用于石油和石化产品分析；1970,s,的,HPLC,用于药物、代谢物和生物化学品的分析。,梯度洗脱：在一个分析周期内，按一定的程序连续的改变流动相中溶剂的组成和配比，使样品中的各个组分都能在适宜的条件下得到分离,荧光衍生化试剂（丹磺酸酰氯、丹磺酸酰阱、荧光胺、OPA等）,蛋白质等能发荧光的物质。,降低背景电导(淋洗液):,固定相：C18/C8上涂渍或在流动相中加入与溶质分子电荷相反 的离子对试剂,Detection：Conductivity (suppressor type),1-Octanesulfonic acid 8.,柱外效应：柱前峰展宽柱后峰展宽,机控制流动相的密度和流量；,易于使用，操作费用低，,1-10 mLmin-1,要点：CO2应用最广泛；,典型的HPLC分析柱尺寸是内径4.,高压泵 无脉冲的注射泵，通过电子压力传感器和流量检测器，计算,基本原理：根据形成的离子对化合物在两相间分配不同而分离。,超临界流体萃取,Supercritical Fluid Extraction,SFE,44,超临界萃取,：基于分离组分溶解度及其与超临界流体分子间作用力的差,别，当超临界溶剂流过样品时，使分离组分溶解在超临界溶剂中。,超临界流体有很好的溶剂化能力，比液体有更大的扩散系数，而且表面张力接近零，较容易渗透到固体的孔隙里，使分离效率和速度大为提高。,常用的超临界流体在常压下多为气体，易同萃取溶质完全分离，使样品得到充分的浓缩而不干扰下一步的分析，,超临界萃取的特点,45,基本解决了溶剂对环境的污染,萃取时间短:,15 45,min,萃取更彻底,可进行热敏样品及痕量样品萃取,节省萃取费用,CO,2,有毒吗？,10.6,实验技术,46,b.,衍生化技术：柱前衍生 柱后衍生,紫外衍生反应,（苯甲酰化反应、二硝基氟代苯反应、苯基异硫氰酸酯反应）,荧光衍生化试剂,（丹,磺酸,酰氯、丹,磺酸,酰阱、荧光胺、,OPA,等）,a.,分离方式的选择,c.,梯度洗脱,47,HPLC,中的梯度洗脱相当于,GC,中的程序升温。,梯度洗脱,：在一个分析周期内，按一定的程序连续的改变流动相中溶剂的组成和配比，使样品中的各个组分都能在适宜的条件下得到分离,固定相,：C18,流动相：20%甲醇,-,水100%甲醇,线性梯度淋洗，2%/,min,流 速：1,mL/min,柱 温：50,C,检测器：紫外检测器,发展趋势,（,LC/MS/FRIR/NMR LC/LC/GC）,1,3,4,3,4,B,C,1,4,3,A,1,2,4,3,五味子,第十章 习题,Page 246,Q.9,，,49,