分离小鼠表皮和真皮细胞的方法.doc

成鼠分离角化细胞

取皮
1. 颈椎脱臼处死小鼠
2. 逆着毛发生长方向剪掉小鼠背毛
3. 用无菌的解剖工具取下小鼠背部皮肤
4. 真皮面向上至于10cm皿中
注意：此时皮肤组织可在冰上放置5-6h，不影响后面的细胞分离。
酶解
5. 灭菌。将皮肤依次置于200ml碘伏中2min，70%乙醇中1min，70%乙醇中1min，无菌PBS中1min
6. 真皮面向上置于10cm皿中
7. 用无菌的解剖的刮去真皮的脂肪组织和肌肉
注意：尽量刮干净，否则影响制备细胞的质量。
8. 10ml的0.25%胰酶，使表皮向上悬于胰酶中，4℃过夜或者37℃2h
分离细胞
9. 将组织放入培养皿盖中，表皮向上
10. 手术镊压住组织边缘，用无菌手术刀将表皮从真皮上刮除
11. 扔掉真皮，将表皮切碎
12. 将切碎的表皮放入50ml的Falcon管中，加入8ml胰酶
13. 移液器吹打组织悬液至组织块分解。约30~60s
14. 加入16mlFAD低钙完全培养基，50μm的细胞过滤器过滤。
注意：过滤器中剩余的组织可用来分离毛发。
15. RT500g离心8min。
16. 移除上清
17. 8mlFAD低钙完全培养基重悬细胞，转移至14ml无菌Corning管中，500g离心8min
18. 4ml加了BSA的PBS重悬细胞
19. 取50μl细胞悬液，加入50μl的台盼蓝，计数
20. 培养。

胎鼠或初生小鼠分离真皮细胞（E16.5到Day2的小鼠）

准备：0.25%无EDTA胰酶与dispase酶1:1混合液
1. 70%乙醇浸泡手术器械进行消毒
2. 颈椎脱臼处死小鼠
3. 依次置于200ml碘伏中2min，70%乙醇中1min，70%乙醇中1min，无菌PBS中1min灭菌消毒
4. 剪去四肢，尾巴以及头部
5. 剥离皮肤，刮除真皮下的多余组织
注意：不要刮太厉害
6. 0.25%无EDTA胰酶与dispase酶1:1混合液消化。5只初生小鼠皮肤可置于一个10cm大皿中，加入15ml混合液，37℃1h
7. 手术刀刮除表皮。刮下的表皮可用于分离表皮细胞。每只小鼠可得到约3x106个表皮细胞
8. 将真皮剪碎。0.25%的胶原酶37℃消化至少1h，UP to 2h
9. 将消化的细胞悬液转移至10ml离心管中，大力震荡至得到单细胞悬液
10. 70μm的过滤器过滤细胞
11. 收集滤过的悬液，500g离心4min
12. 洗3次
13. 计数，接种细胞