免疫组化标准化操作方案.doc

天津赛尔生物技术有限公司

免疫组化操作步骤标准化操作方案

部 门： 免疫组化检测
负 责 人： 魏 华 英
制定日期： 2009年6月16日

目录
一、简介-------------------------------------------------2
二、实验材料-------------------------------------------3
三、实验步骤--------------------------------------------4
四、常见问题与解决方法-----------------------------5

免疫组化
1概述及反应原理
免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。本公司采用的是免疫酶法对抗体进行检测。

2 实验材料、试剂
2.1组织材料
根据检测抗原在组织中的特异表达需要选取组织。
2.2试剂及配方
2.2.1 试剂
试剂名称
生产厂家
纯度级别
无水乙醇
天津市科密欧化学试剂研发中心
分析纯
枸橼酸 (1H20)
天津市化学试剂一厂
分析纯
枸橼酸三钠 (2H20)
天津市化学试剂一厂
分析纯
30% H2O2
天津市风船化学试剂有限公司
分析纯
DAB显色试剂盒
北京中杉金桥
——
中性树胶
国药集团化学试剂有限公司
分析纯
二甲苯
天津市科密欧化学试剂研发中心
——
碳酸锂
天津市化学试剂三厂
分析纯
苏木素
北京化学试剂公司
分析纯
硫酸铝甲
天津市光复科技发展有限公司
分析纯
氧化汞
北京金星化学试剂厂
分析纯
2.2.2试剂配方
（1）10×PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：
NaCl 80.14g
KCl 2.01g
Na2HPO4 15.3
KH2PO4 1.904
加双蒸水至1000 ml，5N的NaOH调pH至7.2～7.4，过滤，室温保存备用。
稀释10倍用
（2）抗原修复液：0.01M 枸橼酸缓冲液 （pH6.0）：
   枸橼酸 (1H20)  0.4 g       
枸橼酸三钠 (2H20)  3g        
加双蒸水至1000 ml，5N的NaOH调pH至6.0，现配现用。
（3）3% H2O2-甲醇溶液
30% H2O2: 甲醇=1：9（v:v），室温保存备用。
（4）5%封闭液：
1×PBS 950ul加入正常羊血清50ul混匀，-20℃保存备用。
（5）本公司制备一抗：按要求比例用1×PBS稀释，现配现用。
（6）与一抗相对应HRP标记二抗按要求比例1×PBS用稀释，现配现用。
（7）DAB显色试剂盒，4℃保存备用。
（8）封片剂：中性树胶，室温保存备用。
（9）苏木素染液
甲液：苏木精2.5g溶入25ml无水乙醇
乙液：硫酸铝钾50g融入500ml蒸馏水
混合甲乙液体，煮沸，缓慢加入氧化汞12.5g，冷却，过滤。
加入20ml冰醋酸，室温保存备用。
（10）1%盐酸酒精
盐酸 5ml
无水乙醇 495ml
于通风橱内将二者混合，室温保存备用，
（11）梯度乙醇
双蒸水与无水乙醇混合配制以下浓度乙醇：100%、95%、90%、85%、70%。室温保存备用。
（12）二甲苯，室温保存备用。
（13）饱和碳酸锂
碳酸锂粉剂加入1000ml双蒸水，搅拌直至饱和状态，室温保存备用。
3.免疫组织化学染色操作步骤
3.1 脱蜡
组织玻片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。
3.2 水化
乙醇100% 10min，乙醇100% 10min， 3% H2O2-甲醇 30min，乙醇90% 10min，乙醇70% 10min，双蒸水10min。
3.3抗原煮沸热修复 
水浴锅加热0.01mol/L枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织切片加热15分钟。PBS洗5分钟，三次。
3.4封闭
滴加5%正常山羊血清封闭液，室温孵育10分钟。甩去多余液体。不洗。
3.5一抗孵育
滴加适量已稀释一抗, 室温孵育30min，4℃过夜后室温孵育。设空白对照以PBS代替一抗，其他处理步骤一致。
3.6二抗孵育
PBS洗三次每次5分钟。滴加适合比例稀释的相应二抗,室温孵育40分钟。PBS洗3次每次5分钟。
3.7 DAB显色
按DAB显色试剂盒操作说明显色，镜下掌握显色程度。自来水冲洗。
3.8复染
苏木素复染30秒到1分钟，自来水冲洗。
3.9 分化
1%盐酸酒精分化1秒，饱和碳酸锂溶液返蓝。
3.10 脱水
梯度乙醇（70%、85%、90%、95%、100%、100%）分别浸泡10分钟
3.11 透明
组织切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。
3.12 封片
滴加1滴中性树胶，盖玻片从一端倾斜盖下，防止气泡产生。
3.13 显微镜观察。

3 结果判断
阳性着色呈棕黄色。根据不同抗原的细胞定位，其棕黄色位于细胞不同位置。根据情况进行分析
4常见问题与解决方法
4.1 染色过强
原因
解决办法
抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长
降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1小时或4℃过夜
孵育温度过高，孵育温度超过37℃
一般室温20-28℃
DAB显色时间过长或DAB浓度过高
显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准
组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失
采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，提高操作速度

4.2非特异性背景染色
原因
解决办法
操作过程中冲洗不充分
每步冲洗3×5
组织中含过氧化物酶未阻断
可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长
组织中含内源性生物素
正常非免疫动物血清再封闭
血清蛋白封闭不充分
延长血清蛋白封闭时间

4.3染色弱
原因
解决办法
抗体浓度过低，孵育时间过短
提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟
试剂超过有效使用期
及时更换试剂
操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释
每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）
室温太低，低于15℃
若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）
蛋白封闭过度
封闭时间不要超过10分钟

4.4染色阴性
原因
解决办法
操作步骤错误
重新试验，设立阳性对照
组织中无抗原
设立阳性对照片，以验证实验结果
一抗与二抗种属连接错误
仔细确定一抗与二抗种属无误

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