©2010-2026 宁波自信网络信息技术有限公司 版权所有
客服电话：0574-28810668 投诉电话：18658249818
浙ICP备2021020529号-1 | 浙B2-20240490
关注我们 ：
1、天津赛尔生物技术有限公司 免疫组化操作步骤标准化操作方案 部 门： 免疫组化检测 负 责 人： 魏 华 英 制定日期： 2009年6月16日 目录 一、简介-------------------------------------------------2 二、实验材料-------------------------------------------3 三、实验步骤--------------------------------------------4
2、 四、常见问题与解决方法-----------------------------5 免疫组化 1概述及反应原理 免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化
3、学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激
4、素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。本公司采用的是免疫酶法对抗体进行检测。 2 实验材料、试剂 2.1组织材料 根据检测抗原在组织中的特异表达需要选取组织。 2.2试剂及配方 2.2.1 试剂 试剂名称 生产厂家 纯度级别 无水乙醇 天津市科密欧化学试剂研发中心 分析纯 枸橼酸 (1H20) 天津市化学试剂一厂 分析纯 枸橼酸三钠 (2H20) 天津市化学试剂一厂 分析纯 30% H2O2 天
5、津市风船化学试剂有限公司 分析纯 DAB显色试剂盒 北京中杉金桥 —— 中性树胶 国药集团化学试剂有限公司 分析纯 二甲苯 天津市科密欧化学试剂研发中心 —— 碳酸锂 天津市化学试剂三厂 分析纯 苏木素 北京化学试剂公司 分析纯 硫酸铝甲 天津市光复科技发展有限公司 分析纯 氧化汞 北京金星化学试剂厂 分析纯 2.2.2试剂配方 （1）10×PBS缓冲液（pH7.2～7.4）： NaCl 80.14g KCl 2.01g Na2HPO4 15.3 KH2PO4 1.904 加双蒸水至1000
6、 ml，5N的NaOH调pH至7.2～7.4，过滤，室温保存备用。 稀释10倍用 （2）抗原修复液：0.01M 枸橼酸缓冲液 （pH6.0）： 枸橼酸 (1H20) 0.4 g 枸橼酸三钠 (2H20) 3g 加双蒸水至1000 ml，5N的NaOH调pH至6.0，现配现用。 （3）3% H2O2-甲醇溶液 30% H2O2: 甲醇=1：9（v:v），室温保存备用。 （4）5%封闭液： 1×PBS 950ul加入正常羊血清50ul混匀，-20℃保存备用。 （5）本公司制备一抗：按要求比例用1×PBS稀释，现配现用
7、 （6）与一抗相对应HRP标记二抗按要求比例1×PBS用稀释，现配现用。 （7）DAB显色试剂盒，4℃保存备用。 （8）封片剂：中性树胶，室温保存备用。 （9）苏木素染液 甲液：苏木精2.5g溶入25ml无水乙醇 乙液：硫酸铝钾50g融入500ml蒸馏水 混合甲乙液体，煮沸，缓慢加入氧化汞12.5g，冷却，过滤。 加入20ml冰醋酸，室温保存备用。 （10）1%盐酸酒精 盐酸 5ml 无水乙醇 495ml 于通风橱内将二者混合，室温保存备用， （11）梯度乙醇 双蒸水与无水乙醇混合配制以下浓度乙醇：100%、95%、90%、85%、70%。室温保存
8、备用。 （12）二甲苯，室温保存备用。 （13）饱和碳酸锂 碳酸锂粉剂加入1000ml双蒸水，搅拌直至饱和状态，室温保存备用。 3.免疫组织化学染色操作步骤 3.1 脱蜡 组织玻片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。 3.2 水化 乙醇100% 10min，乙醇100% 10min， 3% H2O2-甲醇 30min，乙醇90% 10min，乙醇70% 10min，双蒸水10min。 3.3抗原煮沸热修复 水浴锅加热0.01mol/L枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织切片加热15分钟。PBS洗5分钟，三次。
9、3.4封闭 滴加5%正常山羊血清封闭液，室温孵育10分钟。甩去多余液体。不洗。 3.5一抗孵育 滴加适量已稀释一抗, 室温孵育30min，4℃过夜后室温孵育。设空白对照以PBS代替一抗，其他处理步骤一致。 3.6二抗孵育 PBS洗三次每次5分钟。滴加适合比例稀释的相应二抗,室温孵育40分钟。PBS洗3次每次5分钟。 3.7 DAB显色 按DAB显色试剂盒操作说明显色，镜下掌握显色程度。自来水冲洗。 3.8复染 苏木素复染30秒到1分钟，自来水冲洗。 3.9 分化 1%盐酸酒精分化1秒，饱和碳酸锂溶液返蓝。 3.10 脱水 梯度乙醇（70%、85%、90%、95%、1
10、00%、100%）分别浸泡10分钟 3.11 透明 组织切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。 3.12 封片 滴加1滴中性树胶，盖玻片从一端倾斜盖下，防止气泡产生。 3.13 显微镜观察。 3 结果判断 阳性着色呈棕黄色。根据不同抗原的细胞定位，其棕黄色位于细胞不同位置。根据情况进行分析 4常见问题与解决方法 4.1 染色过强 原因 解决办法 抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1小时或4℃过夜 孵育温度过高，孵育温度超过37℃ 一般室温20-28℃ DAB显色时间过长或DAB浓度过
11、高 显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准 组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失 采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，提高操作速度 4.2非特异性背景染色 原因 解决办法 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3×5 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长 组织中含内源性生物素 正常非免疫动物血清再封闭 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间 4.3染色弱 原因 解决办法 抗体浓度过低，孵育时间过短 提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟 试剂超过有效使用期 及时更换试剂 操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥） 室温太低，低于15℃ 若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜） 蛋白封闭过度 封闭时间不要超过10分钟 4.4染色阴性 原因 解决办法 操作步骤错误 重新试验，设立阳性对照 组织中无抗原 设立阳性对照片，以验证实验结果 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗与二抗种属无误 6
©2010-2026 宁波自信网络信息技术有限公司 版权所有
客服电话：0574-28810668 投诉电话：18658249818
浙ICP备2021020529号-1 | 浙B2-20240490
关注我们 ：
