实验原理与方法2.doc

实验原理与方法

蔬菜生理与生态实验室

南京农业大学园艺学院

二零零九年十月

目 录

1、氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）
2、POD（过氧化物酶）活性的测定——愈创木酚法
3、CAT(过氧化氢酶)测定
4、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定
5、谷胧甘肽还原酶(GR)的活力测定:
6、O2-产生速率的测定
7、过氧化氢(H2O2)含量的测定——碘化钾分光光度法
8、丙二醛（MDA）含量的测定
9、还原型抗坏血酸（ASA）和脱氢抗坏血酸（DHA）的测定
10、谷胱甘肽还原酶测定
11、MDAR(单脱氢抗坏血酸还原酶)活性的测定
12、可溶性总糖的测定
13、考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量
14、叶绿素含量的测定
15、石蜡制片的制作
16、激素Indole-3-Acetic Acid（IAA）、Abscisic Acid（ABA）、GA3和ZA的测定
17、cDNA扩增片段长度多态性技术（cDNA-AFLP）
18、3′/5′RACE 扩增基因全长
19、根系活力的测定（TTC法）

47

一 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）

【实验原理】
SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应：

由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替 （ 黄 色 ） ，继而还原生成二甲月替 ，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲
月替 生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。
【仪器、材料与试剂】
（一）仪器
1. 分光光度计
2. 台式离心机
（二）材料
1. 磷酸氢二钠
2. 磷酸二氢钠
3. 甲硫氨酸
4. EDTA-Na2
5. 核黄素
6. 氮蓝四唑(NBT)
7. 陶瓷小研钵
8. 4-5ml 离心管
9. 10ml 玻璃试管
（三）试剂
1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
2. 14.5mM甲硫氨酸溶液：称取1.0818g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至500ml。
3. 3mM EDTA-Na2溶液：称取0.1117g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。
4. 60μM核黄素溶液：称取0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
5. 2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.092g NBT用PBS定容至50ml，避光保存。
【实验步骤】
1. 酶液提取
称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为SOD粗提液。
2. 酶活性测定
（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取配好的Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液6ml， NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后充分摇匀；
（2）分别取3ml反应混合液和40μl（可视情况调整）酶液于指形管中此即反应管；同时做两支对照管，其中1支试管加3ml反应混合液和40μl PBS（不加酶液）作为最大光还原管，另1支加3ml反应混合液和40μl PBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。
（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照25℃下反应20min；
（4）反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度（OD560）
3. 计算结果
已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活单位（U），按下式计算活性
n=[(ODmax-OD560)/ODmax]/2
SOD总活性＝ [( Ack-AE )×V]/（1/2Ack×W×Vt）
SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量
SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时的酶液用量（ml）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。
【注意事项】
1. 酶液提取须在4℃下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降；
2. 植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或pvpp等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。
3. NBT反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。
4. 加反应液时最好在暗光下进行；
5. 核黄素产生O2.，NBT还原为篮甲潛都与光照密切相关，照光强度和时间要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达40μmolm-2s-1，同时使照光时间一样，选择试管尽量一致，照光结束后测一个拿一个（最好晚上做）（温度高时照光时间缩短，温度低时延长）；
6. 测定活性时加入的酶量，以能抑制反应的50％为佳。（一个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量，即以能抑制反应50％的酶量为一个SOD酶活性单位。）
（反应液中加酶液与PBS调零差异不大，反应液调零与其它两个则有一定差异。李合生方法：2支CK管均以缓冲液代替酶液。）
【参考文献】
Beauchamp C, Fridovich I. Superoxide dismutase. Improved assays and an assay applicable to acrylamide gel. Anal Biochem, 1971, 44: 276-287.
Zhou W, Zhao D, Lin X. Effects of water logging on nitrogen accumulation and alleviation of waterlogging damage by application of nitrogen fertilizer and mixtalol in winter rape (Brassica napes L.). J. Plant Growth Regul, 1997,16, 47-53.

二 愈创木酚过氧化物酶（POD）活性的测定----愈创木酚法
【实验原理】
在过氧化物酶催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。
【仪器、材料与试剂】
（一）仪器
1. 分光光度计
2. 台式离心机
（二）材料
1. 磷酸氢二钠
2. 磷酸二氢钠
3. 2-甲氧基酚
4. 30％H2O2
5. 陶瓷小研钵
6. 2ml 离心管
（三）试剂
1. 0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)的配制：分别取A母液(Na2HPO4 )12.3ml和B母液(NaH2PO4 ) 87.7ml混匀即为100ml PBS(0.2M，pH6.0)；
【实验步骤】
1. 酶液提取
称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为酶粗提液。
2. 酶活性测定
（1）反应混合液的配制：取50mlPBS（pH6.0，0.2M）缓冲液于烧杯中，加入28μl愈创木酚（2-甲氧基酚）于磁力搅拌器上加热搅拌，直至溶解愈创木酚溶解，待溶液冷却后加入19μl30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。
（2）酶活性测定：取3ml反应液并加入40μl酶液后测定OD470值在40秒的变化。以PBS代替酶液为对照调零，
3. 计算结果
以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。，按下式计算活性
POD活性=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g FW)
ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）。
【注意事项】
1. 反应液配制时由于愈创木酚难溶，应加热一段时间。加入H2O2前注意溶液冷却，防止H2O2的挥发。
2. 由于该反应迅速，加入酶液要立即进行吸光值的测定。
参考文献
J.L. Muñoz-Muñoz, F. García-Molina, P.A. García-Ruiz, E. Arribas, J. Tudela, F. García-Cánovas, J.N. Rodríguez-López, Enzymatic and chemical oxidation of trihydroxylated phenols, Food Chemistry, Volume 113, Issue 2, 15 March 2009, Pages 435-444
F. Quintanilla-Guerrero, M.A. Duarte-Vázquez, B.E. García-Almendarez, R. Tinoco, R. Vazquez-Duhalt, C. Regalado, Polyethylene glycol improves phenol removal by immobilized turnip peroxidase,Bioresource Technology, Volume 99, Issue 18, December 2008, Pages 8605-8611

三 CAT(过氧化氢酶)的测定

【实验原理】
过氧化氢酶(Catalase,CAT),是一种广泛存在于生物组织中的氧化还原酶，它能催化H2O2分解为水和氧气,清除组织中的过氧化氢。H2O2在240nm处有一个吸收高峰,其吸光度与H2O2的含量成正比,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。单位时间内吸收的差值就是过氧化氢酶的活性。
【仪器、材料与试剂】
（一）仪器
1. 分光光度计
2. 台式离心机
（二）材料
植物叶片等植物材料
（三）试剂
1 0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）： 取A母液(Na2HPO4) 228.75 ml 和B母液(NaH2PO4) 146.25 ml混合后用蒸馏水定容至500ml。
2 0.3％H2O2: 吸取0.5ml 30％的H2O2，用PBS (pH7.0)定容至50ml。
【实验步骤】
1. 酶液提取
称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为CAT粗提液。
2 酶活性测定
（1）反应混合液的配制：取100ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.1546ml 30%的H2O2摇匀即可。
（2）取2.9 ml反应液加入0.1ml酶液，以PBS为对照调零，测定OD240值在40s内的变化。
3 结果计算：酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。
CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t） (u/g FW)
ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）。
【注意事项】
H2O2易分解，应现用现配。
【参考文献】
Aebi H (1984) Catalase in vitro. In: Packer L (ed) Methods in enzymology. Orlando, FL: Academic Press, pp 121–126

四 抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定
【实验原理】
AsA-POD是叶绿体内专一的清除H2O2的酶，催化抗坏血酸(AsA)与H2O2反应，使AsA氧化成单脱氢抗坏血酸（MDAsA）。随着AsA被氧化，溶液的OD290值下降，根据单位时间内OD290的减少值，计算AsA-POD活性。AsA氧化量按消光系数2.8/(mmol/L)·cm（ε＝2.8mM-1.cm-1）计算，酶活性用µmol AsA·g/FW·h 表示。
【仪器、材料与试剂】
（一）仪器
1. 分光光度计
2. 台式离心机
（二）材料
1. 磷酸氢二钠
2. 磷酸二氢钠
3. EDTA-Na2
4. 抗坏血酸
5. 30% H2O2
6. 陶瓷小研钵
7. 2ml 离心管
（三）试剂
（按50个样计算）：
1. 0.05 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0）的配制：母液的配制方法同前取A母液Na2HPO4 61.0ml，加入B母液NaH2PO4 39.0ml，用去离子水定容到400ml。
2. 0.1 mM EDTA-Na2：取0.0093g EDTA-Na2用PBS（pH7.0）缓冲液定容到250ml（372.24 g/M×0.1mM×500ml=0.01861 g）；
3. 5 mM AsA：取0.044g抗坏血酸用PBS（pH7.0）缓冲液缓冲液定容到50ml（现用现配）；
4. 20 mM H2O2：取0.2ml30% H2O2用去离子水稀释到100ml。
【实验步骤】
1. 酶液提取方法同SOD.
2. 酶活性的测定（以2 ml体系测定）
（1）（以2 ml体系测定）取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H2O2，立即在20℃下测定OD290值在40s内的变化，计算单位时间内AsA减少量和酶活性（室温下测定，以不加H2O2为空白对照调零）。
（2）若以3 ml体系测定，则取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入2.60 ml 含0.1mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.15ml 5 mM的AsA，最后加入0.15 ml 20mM H2O2，立即在20℃下测定OD290值在40s内的变化
3. 酶活性计算
以1min内A290变0.01定义为一个酶活性单位u，酶活性以u/g(FW)表示
APX活性（u/g）= △A290.VT/0.01VS.t.W
△A290表示在290nm处吸光值的变化
VT 提取液总体积；VS 酶液的体积；W 叶片的鲜重 ；t 反应时间
【注意事项】
加入H2O2后应混匀反应液然后快速进行比色测定。
【参考文献】
Nakano Y, Asada K. 1981.Hydrogen peroxide scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiol. 22, 867-880

五 GR（谷胱甘肽还原酶）的测定
【实验原理】
【仪器、材料与试剂】
（一）仪器
1. 分光光度计
2. 台式离心机
（二）材料
1. 叶片或根系
2. GSSG
3. NADPH
4. Hepes
（三）试剂
1. Hepes缓冲液 (PH7.8)：称取Hepes 1.9155g,用蒸馏水定容至200ml
2. 10mM GSSG：称取18.3mgGSSG溶于3ml蒸馏水中
3. 2.4mM NADPH：称取4mgNADPH溶于2ml蒸馏水中
【实验步骤】
1. 酶液提取
称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为GR粗提液。
2. GR测定
取样品上清液0.1ml（3次重复），放入试管中，加入Hepes1700ul，NADPH 100ul及其GSSG100ul在OD340下测定。
【注意事项】
1. 酶液提取须在4℃下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降；
2. 植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或pvpp等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。
【参考文献】
Hong Zhu, Zhuoxiao Cao, Li Zhang, Michael A. Trush, Yunbo Li(2007) Glutathione and glutathione-linked enzymes in normal human aortic smooth muscle cells: chemical inducibility and protection against reactive oxygen and nitrogen species-induced injury. Mol Cell Biochem 301:47–59.
Wheeler CR, Salzman JA, Elsayed NM, Omaye ST, Korte DW (1990) Automated assays for superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, and glutathione reductase activity. Anal Biochem 184:193–199.

六 O2-产生速率的测定
【实验原理】
O2-与羟胺反应产生NO2－，NO2－在对氨基苯磺酸和α-萘胺作用下，生成粉红色的偶氮染料，该染料在530nm处有最大光吸收，根据OD530可计算出样品中的O2-的含量。
【仪器、材料与试剂】
（一）仪器
1. 分光光度计
2. 台式离心机
（二）材料
1. 叶片或根系
2. 磷酸氢二钠
3. 磷酸二氢钠
4. 盐酸羟胺
5. 对氨基苯磺酸
6. α-萘胺
7. 冰醋酸
（三）试剂
1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
2. 10mM盐酸羟胺：称取0.05g盐酸羟胺用蒸馏水定容至100ml。
3. 17mM对氨基苯磺酸：称取0.2944g对氨基苯磺酸用冰醋酸溶液（冰醋酸：水=1：3）定容至100ml
4. 7mM a-萘胺：称取0.1002g萘胺用冰醋酸溶液（冰醋酸：水=3：1）定容至100ml。
【实验步骤】
1. 酶液提取
称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶-粗提液。
2. O2-产生速率测定
（1）取0.5ml提取液中加入0.5ml PBS(0.05M，pH7.8)，1ml 10mM盐酸羟胺溶液后摇匀，同时做一对照管以PBS代替样品提取液；
（2）在25℃下保温1小时，若测定叶片保温后需加入2ml乙醚萃取Chl；
（3）依次先加入1ml 17mM对氨基苯磺酸，再加入1ml 7mMα-萘胺，混合后涡旋；
（4）在25℃下保温20min后在3000g离心3min；
（5）以对照管调零,取粉红色水相液测定OD530。
3. 计算结果
根据测得的OD530，查NO2-标准曲线得到[NO2-]，依照羟胺与O2-的反应式：NH2OH＋2O2-＋H+NO2-＋H2O2 ＋H2O 计算[O2-]，即[NO2-]×2=[O2-]。再根据样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，求得O2-产生速率（nmol min-1mg-1蛋白，也可用nmol min-1g-1鲜重）。
【注意事项】
1. 样品中若含有大量叶绿素将干扰测定，可在样品与羟胺温浴后，加入等体积的乙醚萃取叶绿素，再加入对氨基苯磺酸和α-萘胺作NO2-的显色反应；
2. 应用羟胺反应来检测生物材料的含量，必须严格控制反应系统的pH（＜8.0，并尽可能降低反应液中的溶解氧和Fe的含量。因为羟胺自动氧化随反应系统的pH值升高而加强，同时随反应液的溶解氧和Fe含量的增加而加强。
【参考文献】
Desen Ke, Guchou Sun, Zhengxun Wang (2007) Effects of superoxide radicals on ACC synthase activity in chilling-stressed etiolated mungbean seedlings. Plant Growth Regul 51:83–91.
Wang AG, Luo GH (1990) Quantitative relation between the reaction of hydroxylamine and superoxide anion radicals in plants. Plant Physiol Commun 6:55–57.

七 碘化钾分光光度法测定过氧化氢（H2O2）的含量

【实验原理】
过氧化氢(H2O2)既是一种较强氧化剂，又是一种较弱还原剂。它存在范围广，化学性质活泼，对生命体代谢、物质结构性能和环境保护等都有影响。过氧化氢可以与碘化钾发生反应：
H2O2＋2KI→I2＋2KOH
I2通常以I3-的形式存在于水溶液中。利用I3-在352nm有吸收峰这一原理，用分光光度法测定过氧化氢，方法快速简便，干扰少，仪器普及。
【仪器、材料与试剂】
（一） 仪器
1. 分光光度计
2. 台式离心机
3．电子天平
（二）材料
1. 三氯乙酸
2. 酒石酸
3. 碘化钾
4. 过氧化氢（30％）
5．1ml移液枪
6．陶瓷小研钵
7．2ml 离心管
8．100ml容量瓶
（三）试剂
1. 0.1% TCA：称取0.1g三氯乙酸，用蒸馏水定容于100ml容量瓶中。
2. 2%酒石酸溶液：称取2g酒石酸，用蒸馏水定容于100ml容量瓶中。
3. 2.5%碘化钾溶液：称取2.5g碘化钾，用蒸馏水定容于100ml容量瓶中。
4. 过氧化氢标准溶液：取含H2O2的30％标准品过氧化氢3ml，稀释至1000ml，用高锰酸钾标定，再分别稀释成100、10、1及0.1mg/l的过氧化氢标准溶液。
【实验步骤】
1．取1g植物样品，加入0.5mL的0.1% TCA，在液氮下研磨，研磨后所得匀浆以19000g离心20min。
2. 取上清液0.5mL，加2ml 1M KI溶液和0.5ml 100mM硫酸钾的缓冲液，暗反应1h；
3．反应结束后，以0.1%的TCA为参比，测定在390nm处的吸光值；
4．标准曲线绘制：分别取浓度为10.00mg/1的H2O2使用液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00ml于100ml容量瓶中，分别加入2ml 2%酒石酸溶液，2ml lM硫酸溶液，2ml 2.5%碘化钾溶液，用蒸馏水定容后，以试剂空白为参比于352nm处，用1cm比色皿测定吸光度A，作A~ H2O2浓度(mg/1)曲线。
5．通过已知浓度的过氧化氢标准曲线，计算样品中过氧化氢的含量。
【注意事项】
pH值对吸光度有一定的影响，pH2～6时吸光度最大且稳定，故实验采用酸度条件为pH2～6。
【参考文献】
Chakrabarty D. and Datta S. K．Micropropagation of gerbera:lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities during acclimatization process．Physiol Plant,2008,(30):325–331

八 丙二醛（MDA）含量的测定
【实验原理】
MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸（TBA）反应，形成在532nm波长处有最大光吸收的有色三甲基复合物。
【仪器、材料与试剂】
（一）仪器
1. 分光光度计
2. 台式离心机
（二）材料
1. 磷酸氢二钠
2. 磷酸二氢钠
3. 三氯乙酸
4. 硫代巴比妥酸
5. 陶瓷小研钵
6.10ml 离心管
（三）试剂
1． 5%的三氯乙酸（TCA）溶液：称取5g三氯乙酸用少量蒸馏水溶解后定容于100ml容量瓶中；
2. 0.67%（w/v）硫代巴比妥酸（TBA）溶液：称取0.67g硫代巴比妥酸用10%三氯乙酸溶液溶解后定容于100ml容量瓶中。
【实验步骤】
1. 取0.5g样品（叶片或根系）剪碎放入研钵中，加入5ml 5%TCA溶液研磨成匀浆后转入离心管中在3000r/min下离心20min；
2. 取上清液2ml于离心管中，加入等体积的0.67%TBA（硫代巴比妥酸）混和后在100℃沸水浴中煮30min，用冷水迅速冷却后在3000 r/min下离心10min；
3. 取上清液在450nm、532nm、600nm下测OD值（用去离子水调零）；
4. 计算组织中MDA含量：
MDA浓度C (umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450
MDA含量(umol/g FW)=C×V/W
式中V为提取液体积(1.8ml)，W为样品鲜重(0.5g)。
【注意事项】
煮沸后要再进行一次离心
【参考文献】
Kumar G N M, Knowles N R. Changes in lipid peroxidation and lipolytic and free-radical scavenging enzyme activities during aging and sprouting of potato (Solanum tuberosum) seed-tubers. Plant Physiol, 1993, 102: 115－124

九 还原型抗坏血酸（ASA）和脱氢抗坏血酸（DHA）的测定

【实验原理】
抗坏血酸又名维生素C，以两种形式存在于植物中，即还原型抗坏血酸(Ascorbic acid ，AA)和脱氢型抗坏血酸((Dehydroascorbic acid，DHA)。这两种形式可通过氧化还原而互变，因而都具有生理活性。抗坏血酸可以将金属离子还原，使之产生稳定的有色溶液。最通用的是抗坏血酸将Fe3＋还原成Fe2＋，加入螯和剂后，Fe2＋即显色，在络和物最大吸光处测定吸光度，其吸光值同抗坏血酸的浓度成正比。该法可以同时测定抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的含量，脱氢抗坏血酸用二硫苏糖醇还原成抗坏血酸，通过还原前后吸光值的差值对两种物质定量。
【仪器、材料与试剂】
（一）仪器
1. 分光光度计
2. 台式离心机
3．电子天平
（二）材料
1. 偏磷酸
2．磷酸氢二钠
3．磷酸二氢钠
4. 三氯乙酸
5．正磷酸
6．红菲罗啉
7．氯化铁
8．1ml移液枪
9．陶瓷小研钵
10．2ml 离心管
11．5ml、100ml、1000ml容量瓶
（三）试剂
1. 5%的偏磷酸：称取5g偏磷酸（HPO3），定容于100ml容量瓶中。
2． 150mmol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)：：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。
3. 10% TCA：称取0.5g三氯乙酸，用蒸馏水定容于5ml容量瓶中。
4．44%正磷酸：称取2.2g偏磷酸（H3PO4），用蒸馏水定容于5ml容量瓶中。
5．0.5%BP-乙醇：称取1.5g红菲罗啉（BP），用无水乙醇定容于5ml容量瓶中。
6．0.3%FeCl3：98L称取0.3g氯化铁，用蒸馏水定容于100ml容量瓶中。
【实验步骤】
1．称取1g植物材料置于研钵中，加入5mL的5%的偏磷酸，在4℃下下研磨，所得匀浆于22000g离心15 min。
2. 收集上清液用于测定(AsA+DHA)和AsA的含量。取0.3 mL上清液，加入0.75 mL含5 mmol.L-1EDTA的磷酸缓冲液(150 m mmol.L-1，pH 7.4)和0.15 mL 10 mmol.L-1的二硫苏糖醇溶液（DTT）。
3. 室温下放置10 min后，加入0.15 mL 0.5% N-乙基马来酰亚胺以消除多余的DTT。
4．加入0.6 mL的10%三氯乙酸(TCA)、0.6 mL的44%正磷酸溶液、0.6mL的0.5%BP-乙醇溶液和0.15 mL的0.3%(W/V)FeCl3溶液。混匀后40℃水浴40 min，测525 nm处的吸光值。
5． AsA的测定过程中以0.3 mL水代替DTT和N-乙基马来酰亚胺,其余操作步骤如上所述。DHA为总抗坏血酸与AsA的差值。
【参考文献】
Zhang J, Kirkham M B．Antioxidant responses to drought in sunflower and sorghum seedlings．New Phytologist,1996,( 132): 361-373

十 谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性的测定
【实验原理】
谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)可使过氧化物(如H2O2,ROOH等)还原为相应的氧化物：

GPx的活力可用单位时间内催化GSH氧化的减少量表示。GSH可和二硫代对二硝基苯甲酸(DTNB)反应生成黄色的5-硫-2-2硝基苯甲酸阴离子,在412 nm处有最大光吸收,测定该离子的浓度,即可计算出GSH减少的量。

由于上述反应在非酶条件下仍能进行,故计算酶活力时,必须扣除非酶反应所引起的GSH减少量。
【仪器、材料与试剂】
（一）仪器
1. 分光光度计
2. 台式离心机
3．电子天平
4. 水浴锅
（二）材料
1．谷胱甘肽（GSH）
2．磷酸氢二钠
3．磷酸二氢钠
4. 三氯乙酸
5．5，5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）
6．过氧化氢（H2O2）
7．柠檬酸
8．移液枪
9．陶瓷小研钵
10．离心管
11．5ml、100ml、1000ml容量瓶
（三）试剂
1．pH7.8磷酸缓冲液
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。
0.05M pH7.8
A母液 228.75ml+ B母液21.25ml→定容至1000ml
2．1.0mmol/LGSH（当日配制） 3.07mgGSH用PBS溶解至10ml.
3．1.5 mmol/L H2O2（当日配制）取30% H2O215ul,以双蒸水定容至100ml
4．0.61 mmol/L的三氯乙酸（TCA）
5．0.32mol/L Na2HPO4
6．5，5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）显色液：DTNB20mg加1%柠檬酸三钠50mL溶解
【实验步骤】
加入酶提取液1.6mL，冰浴研磨匀浆，4000rpm,离心10min,取上清液再12000rpm，离心5min，上清液供酶活性测定用。取上述酶液0.4ml，分别注入酶管与非酶管，并将非酶管加热失活，分别加入1.0 mmol/LGSH 0.4mL和经37℃预热的H2O20.2mL，立即记时3min,再在2支试管中加入0.61 mmol/L的三氯乙酸（TCA）4mL，3000rpm,离心10min,保留上清液，另取2支试管分别加入上述上清液2.0mL；再取1支试管加入蒸馏水1mL和TCA1.6mL作空白管，并在以上3支试管中分别加入0.32mol/L的Na2HPO4 2.5 mL和5，5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）显色液0.5 mL（显色液内含有0.04%DTNB和1%柠檬酸三钠），反应5min,在412nm处比色读取光密度值。活性单位为umol-1g-1FW。
标准曲线制作:
取1mrnol/LGSH溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml，以双蒸水稀释至10ml，即得到浓度为0、20、40、60、80、100umol/L的GSH标准液，取标准液各2.00ml，移入试管中，加0.32mol/LNa2HPO4溶液2.5ml和DTNB显色液0.5ml，反应5min于412nnl波长读取光密度(双蒸水调零)。以扣除非酶促反应后，在37℃反应每分钟每克蛋白使GSH降低1umol为一个酶活力单位，单位为umol/mg蛋白质·min。。
5.计算方法：

A=标准GSH（um）/标准GSH（OD412）即标准曲线的斜率
【参考文献】
Leopold F loh