微生物检测专题知识讲座.pptx

,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,微生物检测专题知识讲座,微生物检测专题知识讲座,第1页,微生物因为体积小,、,质量轻、适应性强等特点，在自然界中分布很广。但环境条件不一样，微生物种类和数量也不一样。,微生物检测专题知识讲座,第2页,第一节 土壤中微生物,一、土壤是微生物生活良好环境,土壤中生态环境条件,营养（有机质丰富）、水分（有一定含量）、空气（含氧气）、酸碱度（,pH5.55.8,，,适宜）、渗透压（,0.3,0.6,MPa,，等渗或低渗环境,）、温度条件（较恒定）和表面保护层。,故土壤是微生物大本营，也是人类最丰富“菌种资源库”。,微生物检测专题知识讲座,第3页,二、土壤中常见微生物类群,土壤中微生物主要种类有：,细菌（占,70,90,）,10,8,放线菌,10,7,丝状菌,10,6,酵母菌,10,5,藻类,10,4,原生动物,10,3,微生物检测专题知识讲座,第4页,三、土壤中微生物数量与分布,不一样类型土壤中微生物种类和数量是不相同。调查结果表明，有机质含量丰富黑土、草甸土、磷质石灰土等微生物数量多；栗钙土、盐碱土、红壤土、砖红壤土微生物数量较少。（见表,1,）,不一样土层深度土壤中微生物数量和种类也不一样。普通土壤表层微生物数量最多，伴随土层加深，微生物数量逐步降低。,微生物检测专题知识讲座,第5页,表,1,我国各主要土壤含菌量,(,万,/,克干土,),土类 地点细菌放线菌真菌,暗棕壤 黑龙江呼玛,2,32761213,棕壤 辽宁沈阳,1,2843936,黄棕壤 江苏南京,1,4062716,红壤 浙江杭州,1,1031234,砖红壤 广东徐闻,5073911,磷质石灰土 西沙群岛,2,2291,10515,黑土 黑龙江哈尔滨,2,1111,02419,黑钙土 黑龙江安达,1,0743192,棕钙土 宁夏宁武,140 11 4,草甸土 黑龙江亚沟,7,8632923,嵝土 陕西武功,9511,0324,白浆土 吉林皎河,1,598553,滨海盐土 江苏连云港,466410.4,微生物检测专题知识讲座,第6页,1,、取土样,选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约,2cm,土壤，将铲子插入土中数次，然后取,2,10cm,处土壤。,盛土容器应是无菌。将,5,点样品约,1kg,充分混匀，除去碎,石、植物残根等。土样取回后应尽快投入试验，同时取,10-,15g,，称重后经,105oC,烘干,8h,，置于干燥器中冷却后再次称重，,计算含水量。,四、土壤微生物分离和计数,微生物检测专题知识讲座,第7页,2,、倒平板,熔化已灭菌上述,4,种培养基并冷却至,45oC,左右倒平,板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。,微生物检测专题知识讲座,第8页,3,、编号,取,5,支无菌空试管（,15150mm,）依次编号为,10,-3,、,10,-4,、,10,-5,、,10,-6,、,10,-7,。,4,、分装无菌水,按无菌操作用,5mL,移液管分别吸收,4.5mL,无菌水于编号,各无菌空试管中。,微生物检测专题知识讲座,第9页,5.,制备土壤稀释液,称土样,1g,于盛有,99mL,无菌水或无菌生理盐水并装有玻,璃珠三角瓶中，振荡,10,20min,，使土样中菌体、芽孢,或孢子均匀分散，此即为,10-2,浓度菌悬液。用无菌移液,管吸收悬液,0.5mL,于,4.5mL,无菌水试管中，用移液管吹吸三,次、摇匀，此即为,10-3,浓度。一样方法，依次稀释到,10-,7,。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行，整个稀释,过程如图。,微生物检测专题知识讲座,第10页,微生物检测专题知识讲座,第11页,6,、混菌法接种,细菌分离分别准确吸收,10-7,，,10-6,，,10-5,三个稀释度,菌液,1mL,；放线菌分离分别吸收,10-5,，,10-4,，,10-3,三个稀,释度菌液,1mL,；霉菌分离分别吸收,10-4,，,10-3,，,10-2,三个,稀释度菌液,1mL,；酵母菌分离分别吸收,10-6,，,10-5,，,10-4,三个稀释度菌液,1mL,，对号加在已凝固平板上，同时做,空白对照，空白对照只加培养基，不接种菌液。,7.,培养,将涂布后平板上倒置于恒温箱中，细菌在,37oC,下培,养,24,48h,，霉菌在,28oC,下培养,3,5d,，放线菌在,28oC,下培,养,5,7d,，酵母菌,30oC,下培养,2,3d,观察结果。,微生物检测专题知识讲座,第12页,8.,计数,选菌落分散、菌落数适量且各平行皿菌落数靠近稀,释度平皿计数，通常细菌和放线菌选取菌落数在,30,300,之间平皿，霉菌选菌落数在,10,100,之间平皿，最终换,算成每克干土所含菌数。,同一稀释度平均菌落数,稀释倍数,每克干土含菌数,=,1,土壤含水量,微生物检测专题知识讲座,第13页,第二节 水体中微生物,一、水体是微生物天然生境,不论是海水还是淡水水体中，都有着微生物生长所必需营养，有如土壤所具备条件。,微生物检测专题知识讲座,第14页,二、水体中微生物数量和分布,1.,污染淡水,处于城镇等人口聚集地域湖泊、河流等淡水。,10,8,10,9,个,/mL,水,主要是一些能分解各种有机物腐生菌，如芽孢杆菌、生孢梭菌、变形杆菌、大肠杆菌、粪链球菌等。有甚至还含有伤寒、痢疾、霍乱、肝炎等人类病原菌。,微生物检测专题知识讲座,第15页,2.,清洁淡水,（,1,）溪流及贫营养湖,10100,个,/mL,水,以自养型种类为主。常见细菌有绿硫细菌、紫色细菌、蓝细菌、柄细菌、赭色纤发菌、球衣菌和萤光假单胞菌等。另外，还有许多藻类（如绿藻、硅藻等）、原生动物（如钟虫及其它固着型纤毛虫、变形虫、鞭毛虫等）和后生动物（如枝角类、桡足类等）。,（,2,）地下水、自流井、山泉及温泉,有机物和微生物都极少,石油岩石地下水含分解烃细菌，含铁泉水有铁细菌，含硫温泉有硫磺细菌。,微生物检测专题知识讲座,第16页,3.,影响微生物在淡水水体中分布原因,水体类型、污染程度、有机物含量、溶解氧量、水温、,pH,及水深等。,4.,海水,除了一些从河水、雨水及污水等带来暂时种类外，绝大多数是耐盐、嗜冷、耐高渗透压和耐高静水压力种类。海水中常见微生物有假单胞菌属、弧菌属、黄色杆菌属、无色杆菌属及芽孢杆菌属等。普通在港口，每毫升海水含菌量为,1,10,5,个，在外海每毫升含菌为,10250,个。,微生物检测专题知识讲座,第17页,江、河、湖泊、池塘等水体中有机物含量比较多，微生物种类数量也比较多。微生物在水体中表现为水平分布和垂直分布规律。另外，相同水域不一样时期微生物含量及分布也不一样。,微生物检测专题知识讲座,第18页,生活饮用水细菌卫生标准是：细菌总数,100,个,/mL,，大肠菌群值,3,个,/L,。,微生物检测专题知识讲座,第19页,（一）细菌总数测定,菌落总数,需氧情况下，,37,培养,48h,，能在普通营养琼脂平板,上生长细菌菌落总数,.,作用：判定食品被细菌污染程度及卫生质量优劣，对被检样品,做出适当卫生学评价。,基础操作普通包含：,样品稀释倾注平皿培养,48,小时计数汇报。,三、水细菌学检测,微生物检测专题知识讲座,第20页,1,、样品处理和稀释,操作要求：,“无菌操作”落实一直。,充分振摇或研磨,25g,或,25ml,检样,225mL,稀释液,含有玻璃珠灭菌玻璃瓶或乳钵,1,：,10,稀释液。,1ml,1ml,1ml,9ml,稀释液,1,：,100,9ml,稀释液,1,：,1000,9ml,稀释液,1,：,10000,微生物检测专题知识讲座,第21页,降低误差：每递增稀释一次即换用,1,支,1ml,灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入，,勿使吸管尖端伸入稀释液内，而且稀释液应充分振摇。,环境要求：,琼脂平板在工作台暴露,15,分钟，每个平板不得超出,15,个菌落。,代表性：,取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；,液体样品须经过振摇，以取得均匀稀释液。,微生物检测专题知识讲座,第22页,2,、稀释样品取样和倾注平皿,每个稀释度,做两个平皿,将凉至,46,营养琼脂培养基注入平皿约,15ml,，并转动平皿，混合均匀。,1.,取样,倾注平皿,1,：,10,稀释液,225mL,无菌水,1mL,1mL,9mL,稀释液,1,：,100,9mL,稀释液,1,：,1000,1mL,1mL,1mL,1mL,1mL,1mL,1mL,1ml,无菌水,25g,或,25ml,检样,微生物检测专题知识讲座,第23页,3,、培养及计数,培养条件：倒置于,36,1,温箱内培养,48,2h,计数时间：抵达要求培养时间，应马上计数。假如不能马上计数，应将平板放,置于,0,4,，但不得超出,24h,。,菌落总数汇报方式,计平皿中菌落数：,肉眼观察，必要时用放大镜检验。记下各平板菌落总数，求出同稀,释度各平板平均菌落数。,规律：不一样稀释度菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度二个平板菌落,数应基础靠近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈,多。,如出现逆反现象，则应视为检验中差错（有食品有时可能出现逆反现,象，如酸性饮料等），不应作为检样计数汇报依据。,微生物检测专题知识讲座,第24页,当计数平板内菌落数过多（即全部稀释度均大于,300,时），但分布很均匀，可取平板二分之一或,1/4,计数。再乘以对应稀释倍数作为该平板菌落数。,当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长菌落之间无任何显著界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不一样起源链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板普通不宜采取，如片状菌落不到平板二分之一，而另二分之一又分布均匀，则能够半个平板菌落数乘,2,代表全平板菌落数。,微生物检测专题知识讲座,第25页,菌落总数汇报方式,计数标准：,选平均菌落数在,30300,之间者进行计算,2.,若有,2,个稀释度平均菌落数在,30300,之间时，则按二者菌落总数之比来决,定，若比值小于,2,应汇报二者平均数；若大于,2,则汇报其中较小菌落总数。,3.,若全部稀释度平均菌落数均大于,300,，以稀释度最高平均菌落数乘以稀释倍,数汇报之。,4.,若全部稀释度平均菌落数均小于,30,，则应按稀释度最低平均菌落数乘以稀,释倍数汇报之。,5.,若全部稀释度平均菌落数均不在,30300,之间，则以最靠近,300,或,30,平均菌,落数乘以稀释倍数汇报之。,6.,若全部菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样最大稀释倍数。,7.,在求同稀释度平均数时，若其中,1,个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜,采取，而应以无片状菌落生长平板作为该稀释度平均菌落数。若片状菌落约,为平板二分之一，而另二分之一平板上菌落分布很均匀，则可按半平板上菌落计数，,然后乘以,2,作为整个平板菌落数。,1.,仅,1,个稀释度平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报,告之。,微生物检测专题知识讲座,第26页,汇报标准,菌落总数汇报方式,例次,不一样稀释度平均菌落数,两个稀释度菌落数之比,菌落数,(,个,/mL),汇报方式(个/mL),10,-1,10,-2,10,-3,1,1365,164,20,16400,16000,或,1.610,4,2,2760,295,46,1.6,37750,38000,或,3.810,4,3,2890,271,60,2.2,27100,27000,或,2.710,4,4,无法计数,4650,513,513000,510000,或,5.110,5,5,27,11,5,270,270,或,2.710,2,6,无法计数,305,12,30500,31000,或,3.110,4,7,无法计数,10,-3,无法计数,微生物检测专题知识讲座,第27页,4,、,菌落总数汇报方式,菌落数汇报，按国家标准方法要求菌落数在,1100,时，按实有数字汇报，如大于,100,时，则汇报前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。为了缩短数字后面零位，可用,10,指数来表示。,固体检样以克（,g),为单位汇报，液体检样以毫升（,mL,）为单位汇报，表面涂擦则以平方厘米（,cm,2,）汇报。,微生物检测专题知识讲座,第28页,作业：,对某一自选食品进行微生物学检验设计。,关键点：,1.,食品相关统计（名称、厂家、商店等）,2.,所用物品起清单（设备及易耗品等）,3.,工作计划（人员安排、进度计划等）,4.,汇报格式（表格设计及汇报高书等）,微生物检测专题知识讲座,第29页,(,二,),大肠菌群测定,国家标准采取三步法,1,、检验查表方法,大肠菌群,需氧及兼性厌氧、在,37,能分解乳糖产酸产气革,兰氏阴性无芽胞杆菌。,乳糖发酵试验,分离培养,证实试验,样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。,361,培养,482h,，观察是否产气。,将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，,36,1,培养,18-24h,，观察菌落形态。,挑取平板上可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管,36,1,培养,24,2h,，观察产气情况。,依据证实为大肠杆菌阳性管数，查,MPN,表，汇报每,100ml,（,g,）大肠菌群,MPN,值。,微生物检测专题知识讲座,第30页,较清洁样品三步法图示,100mL,50mL,三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液,100mL,5mL,5mL,5mL,5mL,5mL,5mL,5mL,5mL,5mL,5mL,水样,10mL,10mL,10mL,10mL,10mL,10mL,10mL,10mL,10mL,10mL,微生物检测专题知识讲座,第31页,三步法图示,取产酸产气发酵管中培养液在伊红美兰平板上进行划线,取有关键和带金属光泽深紫色菌落进行革兰氏染色,乳糖蛋白胨培养液,镜检（,革兰氏阴性菌,）,37,培养,48h,证实产气（阳性）结果是否,37,培养,24h,37,培养,24h,微生物检测专题知识讲座,第32页,大肠菌群测定,2,、计算方法,挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落；,红色、粉红色菌落。,抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。,为阴性结果水样体积（,mL,）,全部水样体积（,mL,）,MPN,1000,为阳性结果发酵管（瓶）数目,产酸判断：紫色培养液变成黄色,产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试管有气泡沿管壁,上浮，应考虑可能有气体产生，需深入试验。,微生物检测专题知识讲座,第33页,美国,FDA,标准方法,行业标准采取两步法：,用于对出口食品中大肠菌群进行检验,推测试验,证实试验,样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管,LST,肉汤发酵管。,361,培养,482h,，观察是否产气。,将产气发酵管培养物转种于煌绿乳糖胆盐（,BGLB,）肉汤中，,36,1,培养,482h,，,观察是否产气,。,以,BGLB,产气为阳性，查,MPN,表，汇报每,ml,（,g,）样品中大肠菌群,MPN,值。,微生物检测专题知识讲座,第34页,练习：,如对一自来水厂出水进行检验，初发酵普通在,10,支小发酵管和两支大发酵瓶内进行，复发酵在,5,支小发酵管内进行。以,300mL,进行初发酵试验，其中,100mL,水样,2,份（分状于,2,个大发酵瓶中），,10mL,水样,10,份，（分状于,10,支个小发酵管中）。试验结果：,100mL,2,份水样为阴性结果，无大肠杆菌存在；,10mL,水样中有,5,份为阳性结果，存在大肠杆菌。则：,MPN=?,微生物检测专题知识讲座,第35页,第三节 空气中微生物,空气生态条件,不适合微生物生长繁殖。（营养不足、紫外线照射、水分少）。,微生物检测专题知识讲座,第36页,一、空气微生物起源,空气中微生物主要来自土壤飞起来灰尘、水面吹起水滴、生物体体表脱落物质、人和动物排泄物等。,微生物检测专题知识讲座,第37页,二、空气中微生物数量和分布,空气中微生物大个别是腐生种类，不过不一样空气环境中微生物种类不一样。有些种类是普遍存在，如一些霉菌、酵母菌、真菌孢子。细菌主要是来自于土壤腐生性种类，常见为各种球菌、芽孢杆菌、产色素细菌等。,空气中微生物分布随环境条件及微生物抵抗力不一样而展现不一样分布规律。空气中微生物数目决定于尘埃总量。空气中尘埃含量越高，微生物种类数量越多。,微生物检测专题知识讲座,第38页,表,4-2,不一样条件下,1,m,3,空气含菌量,条 件,数 量,畜舍,1,210,6,宿舍,0,城市街道,5000,市区公园,200,海洋上空,1,2,北极（北纬,80,o,）,0,微生物检测专题知识讲座,第39页,三、空气微生物卫生标准,室内空气污染指标：,500,1000,个,/m,3,。,清洁程度,细菌总数（个,/m,3,）,清洁程度,细菌总数（个,/m,3,）,最清洁空气,1,2,临界环境,150,清洁空气,30,轻度污染,301,微生物检测专题知识讲座,第40页,四、空气中微生物检测方法,常见检验方法是沉降平板法，即测定在一定时间内从空气中降落到单位面积地面上微生物个数。操作过程以下：,将融化营养琼脂培养基倒入,d90mm,无菌培养皿中制成平板。均匀布设在待测处地板上（普通最少设,5,个待测点），打开皿盖,510min,，让空气中微生物降落在平板表面，盖好皿盖，然后倒置放入培养箱中，在,37,条件下培养,48h,后计菌落数。,微生物检测专题知识讲座,第41页,