血管内皮祖细胞(EPC)与自体骨髓干细胞移植.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,血管内皮祖细胞（,EPC,）与自体骨髓干细胞移植,首都医科大学血管外科研究所,首都医科大学宣武医院血管外科,吴英锋 谷涌泉 郭连瑞 张建,1997,年,Asahara,等首先描述了循环于外周血中的内皮祖细胞,（,endothelial progenitor cell,，,EPC,）,。,应用免疫磁珠法首先从外周血分离,CD34,+,细胞，经在纤维连接蛋白（,fibronectin,Fn,）预衬的培养皿培养，这些细胞转变成内皮特征细胞。,意义：,（,1,）更正并充实了长期以来人们所认识的血管新生机制,（,2,）为缺血性疾病及恶性肿瘤的治疗提供了新的靶点,血管内皮祖细胞（,EPC,）,概念,EPC,又称为血管母细胞,/,成血管细胞（,angioblast,）,是指能分化为血管内皮细胞的前体细胞，包括从血液血管干细胞,(hemangioblast),到成熟内皮细胞之间的,多个阶段,的细胞。,换句话说，,EPC,是向成熟内皮细胞分化过程中的具有特殊表型和特性的,过渡,细胞群体。,血管内皮祖细胞（,EPC,）,来源（一）,普遍认为内皮细胞系与造血细胞系共同来源于中胚层的一种共同祖先细胞,血液血管干细胞,(1),胚胎发育上的时空联系：在鼠胚,7.5,日龄、人胚,13,日龄胚外造血启动，卵黄囊的胚外中胚层聚集成血岛（,blood island,）。位于血岛外层的细胞分化成原始的血管内皮细胞，血岛中央的细胞则变成原始的造血细胞。多个血岛腔隙相互联结成网状结构，形成原始血管床，此过程称之为血管发生,(vasculogenesis),。,(2),造血细胞与血管内皮细胞共同具有众多细胞表面标记：,SCL/TAL-1,、,CD34,、,VEGFR-2,、,GATA-2,、,PECAM-1,、,Tie-1,、,Tie-2,和,CD133,等。,(3),某些胚胎源细胞的双系分化能力：有人用,VE-cadherin,从胚胎中分离到不表达,CD45,和,Ter119,的“内皮细胞”，发现该细胞可产生包括,T,和,B,淋巴细胞在内的造血细胞，证明了胚胎期内皮细胞系与造血细胞系的同源性。同时有实验表明，小鼠、鹌鹑、鸡的胚胎干细胞、,Flk-1,+,细胞、,Tie-2,+,细胞及,VE-cadherin,+,细胞在不同生长因子刺激下可同时产生造血和内皮系细胞,血管内皮祖细胞（,EPC,）,来源（二）,Reyes,等人从人及啮齿类动物的骨髓中分离出一种多潜能成体祖细胞（,multipotent adult progenitor cell,MAPC,），细胞表型为,CD34,-,/HLA-DR,-,/CD133,+,/VEG,FR-2,+,同时胚胎干细胞表面标记,Oct-4,+,。这种细胞增殖,80,代未见衰老，同时单个,MAPC,既能分化为中胚叶的肢芽组织细胞（脂肪细胞、基质细胞、成骨细胞等），又能分化为中胚叶的内脏组织细胞（内皮细胞）。在,VEGF,诱导下，能产生,CD34,+,/VE-cadherin,+,/flk-1,+,细胞，后者恰与,EPC,的表型一致,来源（三）,CD45,+,的单核、巨噬细胞,来源（四）循环于血液中脱落的内皮细胞,图,1 EPC,的来源，,AB,代表,angioblasts,血管内皮祖细胞（,EPC,）,分子标记及生物学特性,从形态特征上不能与成熟血管内皮细胞区别,近年来发现,CD133,在,EPC,表达而在成熟血管内皮细胞则无表达,一般认为，早期,EPC,的三个表面标志性抗原：,CD133,、,CD34,和内皮细胞生长因子受体,-2,（,VEGFR-2,）,后者在人类称,KDR,在鼠类称,flk-1,血管内皮祖细胞（,EPC,）,分子标记及生物学特性,骨髓中的早期,EPC,尚不表达,VE-cadherin,和,vW,因子，在成体外周血中发现的,EPC,是较成熟的,EPC,，基本失去了,CD133,抗原但仍保留,CD34,和,VEGFR-2,阳性，外周血的,EPC,还以不同强度表达内皮系的其他标志分子：,CD31,、,CD146,、,VE-cadherin,、,vW,因子和内皮型,NO,合成酶等，成熟的血管内皮细胞（,EC,）则高表达,VEGFR-2,、,VE-cadherin,和,vW,因子,CD133,抗原的丢失标志着外周循环中的,EPC,在向着成熟,EC,转化,血管内皮祖细胞（,EPC,）,较高的数量和迟发的高增殖潜能,实验证明，外周循环中成熟的,EC,数量极少，约,2.61.6,（,2-3,）个,/ml,，,而,EPC,则约,500-1000,个,/ml,，两者比较相差悬殊,成熟微血管内皮细胞在体外能很快进入增殖期，但,4-6,周（,8-10,代）后增殖活力即逐渐下降。与此相反，外周血、胎肝、骨髓来源的,CD34,+,细胞在,15-20,天后形成迅速生长的鹅卵石样内皮细胞层，并能稳定传代,30,次以上，其增殖潜能是脐静脉内皮细胞的,10,倍。,Lin,等发现骨髓来源的,EPC,与,EC,体外扩增能力之比为,50:1,。,血管内皮祖细胞（,EPC,）,动员,不同祖系的细胞由骨髓释放到外周血称为动员,许多生长因子、酶、配基及表面受体调节,EPC,的动员,基质金属蛋白酶,-9,（,MMP-9,）的活化可能是动员的第一步,其他促使动员的信号尚不清楚，但至少包括来自外周的促血管生长因素,明显的例子包括肢体缺血、血管损伤、烧伤和冠脉旁路术后循环中,EPC,数量的迅速增加，这些事件都与内源性,VEGF,水平的增高有关,血管内皮祖细胞（,EPC,）,分离,EPC,可从脐带血及成体外周血、胎肝、骨髓中获取,目前，分离,EPC,的方法主要有以下两种,（,1,）根据,EPC,表型用免疫磁珠法获得。先用,Ficoll,液密度梯度离心获取单个核细胞，然后用标记有相应细胞表面抗体的免疫磁珠将单个核细胞中的带有特定表面抗原的,EPC,筛选出来，一般选用,CD34,和,/,或,CD133,免疫磁珠,（,2,）贴壁法特定培养基分化分离,EPC,。通过密度梯度离心得到单个核细胞后，把这些细胞接种在表面涂有胞外基质（主要用,Fn,）培养容器里，使用添加有特殊生长因子的培养基培养。这些特殊的促生长因子有,VEGF,、干细胞生长因子（,SCGF,）、牛脑提取物以及复加,bFGF,、,IGF,、,EGF,、,ascorbic acid,的混合物,EGM-2MV,培养液,(,包含,5%FBS,、,VEGF,、,hFGF-b,、,hEGF,、,IGF-1,、,Hydrocortisone,和,Ascorbic acid,等,)(Cambrex),，,IMDM,培养液,(Hyclone),，,DMEM,完全培养液,(,中日友好临床医学研究所,),，,FBS(Hyclone),Fibronectin(Sigma),，,Histopaque-1077(Sigma),，,MTT(Sigma),，,Dil-ac-LDL(BTI),抗,因子单抗,(Zymed),，抗,flk-1,单抗,(Santa Cruz),，抗,CD133,单抗,(Miltenyi Biotec),APC,标记的,CD34,单抗,(BD),，,FITC,标记的,CD133,单抗,(R&D),，,PE,标记,VEGFR-2,单抗,(R&D),酶标仪,(Pasteur),，流式细胞仪,(Becton Dickinson),，,Olympus,倒置相差显微镜，,Olympus,普通光学显微镜，,Nikon,荧光显微镜，,JEM-1010,型透射电子显微镜,(JEOL),贴壁培养材料和仪器,技术路线,犬骨髓,10,18ml(n=5),获取单个核细胞,(BMMNC),Fn,衬底,EGM-2MV,培养,接种,24,孔板玻片,送,FCM,梯度密度离心,3,、,7,日免疫组化,原代汇合,(,平均,10,天,),第,7,日送,FCM,第,10,日送,FCM,爬片作免疫组化,传代，继续培养,生长曲线测定,TEM,检测,犬颈外静脉,酶法获取,EC,2%,明胶衬底,DMEM,培养,原代汇合,继续培养,Dil-ac-LDL,摄取实验,IMDM,培养,原代汇合,继续培养,培养,48,小时，可见长梭形、三角形、纺锤形或不规则形贴壁细胞呈集落样生长,第,9,11,日，原代细胞汇合成层，近似单层铺路石状排列,结 果,第,48,小时（,200,）,EPCs,原代汇合时（,200,）,原代汇合时，平均每毫升骨髓可获细胞约,(1.3,0.3),10,6,细胞生长曲线,第,5,代，细胞增殖明显减缓,结 果,*,*,免疫细胞化学,F-,EPCs ECs MSCs,VEGFR-2,CD133,-actin,TEM,检测,EC EPC MSC,功能检测：,绝大多数细胞呈阳性反应,EPC,EC,MSC,Dil-ac-LDL,摄取实验,增殖效率：,新分离的,BMMNCs,，,CD34,、,VEGFR-2,和,CD133,三个表面抗原均阳性的细胞占,0.12%,第,10,天，,VEGFR-2,和,CD133,双阳性细胞达,29.03%,，,增加了,242,倍,流式细胞术,目前，获取,EPCs,的方法主要有两种,表面抗原分离法,具体采用免疫磁珠法获得,离体扩增培养法,表面抗原分离法不可能获得纯度较高的,EPCs,上述三种细胞表面抗原也同时存在于造血干细胞,尚存在,CD34,内皮祖细胞,免疫磁珠法具有操作复杂、反复筛洗使获取细胞活性降低、费用高等缺点，不适于临床应用和大规模培养,离体扩增培养法不仅可以克服上述缺陷，还因为,BMMNCs,中含有,CD34,+,和,CD34,-,细胞，共培养这些细胞还可促进,CD34,+,的,EPCs,增殖,讨 论,新分离的,BMMNCs,中的含有也同时表达上述三个表面抗原的,HSCs,，而扩增,10,日的贴壁细胞中不会含有,HSCs,，故实际扩增倍数要高得多,免疫细胞化学和流式细胞术,因子亦呈明显阳性反应，说明,EPCs,在向成熟方向,ECs,转化,阳性细胞率不完全一致,两种方法的敏感性不一致,目前没有商品化的犬的单克隆抗体可利用,胰蛋白酶消化贴壁细胞时也破坏了一定数量的细胞表面抗原,讨 论,结论（,1,）,应用离体扩增培养法可成功地从骨髓中分离培养并扩增出一个具有,EPCs,特征的细胞群体：,单层鹅卵石样外观，,CD133,、,因子相关抗原和,VEGFR-2,阳性，接近于,ECs,的超微结构，能够摄取,Dil-ac-LDL,这些细胞具有,较高的增殖能力,胚胎干细胞向内皮细胞分化,1996,年，,Vittet D,等采用小鼠,ESC,定向分化产生血管内皮细胞,2002,年，,Levenberg S,等从人,ESC,诱导分化出血管内皮细胞,ESC,来源的血管祖细胞具有体内成血管作用,试剂配制,鼠,ESC,培养基：,高糖,DMEM,，含,15%FBS,（胎牛血清），,100 mmol/L NEAA,（非必需氨基酸），,0.55 mmol/L,-ME,（,-,巯基乙醇）,，,0.1 mmol/L L-GLU,（,L-,谷氨酰胺），,105U/L PS,（青链霉素）。使用前添加,10,6,U/L LIF,（白血病抑制因子）。,分化培养基：,不含,LIF,的,ESC,培养基添加终浓度,50ng/ml,的,VEGF,（血管内皮生长因子）。,VB,分化培养基：,不含,LIF,的,ESC,培养基，添加,VEGF 50ng/ml,、,bFGF,（碱性成纤维细胞生长因子）,100ng/ml,。,细胞冻存液：,50%ESC,培养基，,40%ES,专用胎牛血清，,10%DMSO,，混匀后备用（现用现配）。,ESC,的形态学观察,鼠,ESC,在饲养层上能保持未分化状态，细胞团形态呈鸟巢样，边缘清晰，单个细胞体积小，折光性强，核质比高，集落大小不等，与索条状的,MEF,分界清晰，未见分化细胞,脱离饲养层细胞后，在,LIF,的作用下，集落周边可出现扁平的细胞突起，呈现出轻微的分化状态,200,200,ESC,的鉴定,碱性磷酸酶检测：,鼠,ES,细胞集落全部红染，为碱性磷酸酶染色阳性（,100,）,ESC,的鉴定,Oct-4,：,200,ESC,的鉴定,SSEA-1,200,拟胚体形成,悬浮培养法：,以,0.25%,的胰酶,/EDTA,消化接近完全融合的鼠,ESC,，离心去上清，重悬计数。将细胞悬液按不同的密度接种至,低粘附,的培养皿中，采用不同的培养基培养，观察细胞形成悬浮的球形细胞团，即拟胚体（,embryoid body,，,EB,）的数量及生长状态。,拟胚体形成：悬浮培养法,Day2,Day9,Day4,Day12,200,ESC,的分化诱导,简单两步法,第一步：,EB,形成：,采用悬浮培养法,第二步：,EB,的直接种植培养：,取培养第,4,天的,EB,悬液，按,50-100,l/,孔用量移入,0.1%,明胶,预衬的,6,孔培养板中，以,分化培养基,培养，每,1-2,天换液一次，换液时以,PBS,或,Hanks,液洗去未贴壁细胞。待细胞至,70%-80%,融合时，进行消化传代，即为,ESC-EC P1,。一般,5-7,天传代一次，多余细胞冻存。,拟胚体的分化种植,将,Day4,的,EB,直接种植，采用,分化培养基,培养，,6,小时内即贴壁生长，,24h,后可见从贴壁生长的,EB,周围出芽样长出梭形或多角形细胞，向外放射状生长，并与周围集落融合。,EB Day4,，,400,Day1,，,200,Day2,，,100,Day4,，,100,Day9,，,100,Day15,，,100,分化细胞的鉴定,DiI-Ac-LDL,摄取实验：,P9,P9,，,400,分化细胞的鉴定,DiI-Ac-LDL,摄取实验：,L929,（阴性对照）,400,分化细胞的鉴定,荧光双染：,DiI-Ac-LDL,摄取及,FITC-UEA-1,P1,，,400,分化细胞的鉴定,免疫组化染色：,CD31,空白对照，,400,P15,，,400,分化细胞的鉴定,免疫组化染色：,Flk-1,空白对照，,400,P15,，,400,分化细胞的鉴定,流式细胞仪检测：,CD31,阳性细胞比例逐渐增加，第,2,代（,P2,）时即可达,71.7%82.4%,（平均,76.6%,），,P6,时则达,84.8%90.1%,（平均,86.1%,），不断传代后最终维持在,90%,左右的较高水平。,P2,P6,P9,分化细胞的鉴定,透射电镜检测：,分化产生的细胞胞质内细胞器丰富，核周有散在的粗面内质网和丰富的糖原颗粒，线粒体甚为丰富。,分化细胞的鉴定,透射电镜：,细胞膜下及胞质内常见大小不等的吞饮小泡及多泡小体。,分化细胞的鉴定,透射电镜：,Weibel-Palade,（,W-P,）小体，是位于胞浆内的棒状呈束的微管，周围有单层膜包被。,结论（,2,）,采用简单的贴壁培养，单独采用,VEGF,即可成功诱导小鼠胚胎干细胞分化产生内皮样细胞。,经传代培养后，分化细胞中,CD31,阳性细胞可达到,90%,以上，纯度高。,EPC,的临床应用与骨髓干细胞移植,血管新生（,neovascularization,）有三种方式：血管生成（,angiogenesis,）、血管发生（,vasculagenesis,）和动脉生成（,arteriogenesis,）,血管生成是指通过血管内皮细胞迁移、增殖，在原有的血管上以出芽的方式生长出新的血管；血管发生是指在原来没有血管系统的情况下，通过,EPCs,和造血干细胞产生血流的新通道,传统观念认为,vasculagenesis,仅和,angiogenesis,共存于胚胎发育时期，而不参与出生后的血管新生。正是,1997,年,Asahara,等首先报道了,“,出生后血管发生（,postnatal vasculagenesis,）,”,，才使这一观念得以纠正,目前认为：,vasculagenesis,和,angiogenesis,不仅共存于胚胎发育时期，而且还参与出生后的血管新生,图,2,血管生成和血管发生,EPC,参与出生后诸多的生理过程,补充血管壁脱落的,EC,女性子宫和卵巢的周期性变化都有血管发生的参与,转基因小鼠的系统研究证明，在脑、肺、肝、肠、皮肤及肌肉的血管中都整合有一定的转化细胞，在排卵期的黄体和子宫内膜上尤为明显,EPC,的临床应用与骨髓干细胞移植,EPC,参与了出生后诸多的病理过程,肢体缺血,心肌梗塞,肥胖相关疾病：,型糖尿病、高血压、高血脂,糖尿病视网膜病变,肿瘤,动脉粥样硬化,EPC,的临床应用与骨髓干细胞移植,治疗性血管发生（,therapeutic vasculogenesis,）,1999,年，,Isner,等首先提出了,“,治疗性血管发生,”,的概念,倡导以提高补充,EPC,数量来增加血管生长因子的作用底物，达到更好的血管新生效果，治疗缺血性疾病,这一疗法充分利用成年机体血液循环中存在,EPC,、,EPC,对缺血组织的自动趋化能力和归巢能力、,EPC,能分化形成血管的生物学特性，可以说是一个生理加强疗法。,EPC,的临床应用与骨髓干细胞移植,治疗性血管发生,治疗肢体缺血（图,3,）,EPC,功能分类,Early EPC:,来源于,CD14+,细胞,Late EPC:,来源于,CD14-,细胞,Mukai N,，,et al.Experimental cell research,2 0 0 8,，,3 1 4,：,4 3 0,4 4 0,治疗肢体缺血,大量的动物实验表明，外源,EPC,有助于缺血肢体模型的血管化,hintani,等用家兔下肢缺血模型研究，经血管造影、激光多普勒、缺血组织切片毛细血管密度观察，发现细胞移植组侧支血管形成及血管新生均有明显改善,Crosby,等用有基因组标记的转基因小鼠的胎肝细胞移植经射线照射的小鼠，随后在小鼠背部皮下植入小海绵，,4,周后取出海绵和一些未损伤的皮肤、动脉和脑标本制成切片。计数切片中总的内皮细胞，发现海绵中来源于供体,EPC,的内皮细胞占总内皮细胞数的,8.3%-11.2%,，而在正常组织中只占,0.2%-1.4%,治疗急性心肌梗塞,心梗后坏死心肌不能停止疤痕化，存活心肌代偿性肥大、左心室结构重排，即,“,心室重建,”,，最终发展为心衰,EPC,治疗急性心梗有很多成功的动物研究报道,临床上,Strauer,用自体骨髓单个核细胞移植治疗一名大面积心梗的患者获得成功，植入的细胞成功的再造了被破坏的心肌组织和血管组织,治疗急性心肌梗塞,可能机理,EPC,在梗塞核心区以血管发生的方式形成新毛细血管,和其它细胞共同分泌,VEGF,等生长因子，刺激梗塞边缘区健康小血管通过血管生成方式发芽生长,在和有活力心肌细胞接触过程中，横向分化为心肌细胞参与重建,肿瘤细胞可分泌多种与血管生成有关的细胞因子如,bFGF,、,aFGF,、,VEGF,、,HGF,和,angiopoietin,等，这些细胞因子动员骨髓,EPC,进入血液循环并参与肿瘤的血管生成,在肿瘤分泌的细胞因子作用下，,EPC,可定向归巢于肿瘤。利用抑制血管发生因子偶联于,EPC,可抑制肿瘤的生长,将某些抗肿瘤基因或自杀基因修饰后的,EPC,移植入体内，定位于肿瘤的血管新生部位，通过,“,Trojan Horse,”,效应表达抗肿瘤生长因子，也可破坏肿瘤细胞的生长和转移,治疗肿瘤,组织工程产物的血管化是目前遇到的一个普遍问题，尤其是大器官的血管化问题,研究表明，仅靠营养的渗透作用，体积超过几个立方毫米的人工组织就不能存活,EPC,的高增殖潜能又成为一个有希望的组织工程血管的种子细胞来源,动物试验方面，已经有,EPC,种植于血管移植物管腔内面，动物体内证实了其良好的抗血栓形成潜能。,其临床应用也在进一步研究当中,组织工程产物血管化,治疗肿瘤,基因修饰还可用来改变,EPC,的生物学形状，从而增强其治疗的活性,Iwaguro,等证实体外,VEGF,基因转导增强了,EPC,的增殖、黏附功能，较未转导者的,VEGF,表达高两倍。将转导细胞注入无胸腺裸鼠的缺血后肢，新血管形成和血流恢复均提高,Murasawa,等则利用端粒酶逆转录酶转染,EPC,，通过提高端粒酶的活性使,EPC,的有丝分裂活性、迁移活性、细胞存活和血管新生能力均得到提高，为,EPC,基因修饰开拓了一条新道路,基因治疗的安全性仍是一个普遍争论的问题，其临床应用时机还不成熟,基因载体,结语,EPC,在成体的分离和培养是一个重大的发现,EPC,有着广泛的临床应用前景,EPC,的广泛的应用还需要大量的临床前研究工作,结语,存在的问题（举例）,EPC,生物学特性（低剂量生长激素、阿司匹林、,HDL,、红酒、二手烟等）,EPC,富集、分离纯化方法的改进,EPC,治疗的适应症、途径,基因治疗的安全性,促血管发生与促肿瘤生长的矛盾,Thank you,