DB22∕T 2694-2017 灵芝孢子粉中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定 液相色谱法(吉林省).pdf

ICS 65.020.01 B 38 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 26942017 灵芝孢子粉中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的测定 液相色谱法 Determination of aflatoxin B1、B2、G1、G2 content in ganoderna lucidum sporesliquid chromatography 2017-09-30 发布 2017-11-30 实施 吉林省质量技术监督局 发 布 DB22/T 26942017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。本标准由中人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。本标准主要起草人：杨璐、胡婷婷、李荣荣、陈明岩、赵韫慧、宋清莲、顾婷婷、曹海微。华DB22/T 26942017 1 灵芝孢子粉中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的测定 液相色谱法 1 范围 本标准规定了灵芝孢子粉中黄曲霉毒素测定 液相色谱法的原理、试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤、试验数据处理、精密度及试验报告。本标准适用于灵芝孢子粉中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 的测定。本方法检出限：黄曲霉毒素B1、G1 为 1.0 g/kg，B2、G2 为 0.25 g/kg。本方法定量限：黄曲霉毒素B1、G1 为 2.5 g/kg，B2、G2 为 0.75 g/kg。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 样品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 用甲醇水混合溶液提取，提取液经免疫亲和柱净化，液相色谱仪测定，外标法定量。4 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.1 水，GB/T 6682，一级。4.2 氯化钠（NaCl）。4.3 乙酸铅（C4H6O4PbH2O）。4.4 甲醇（CH3OH）：色谱纯。4.5 饱和乙酸铅溶液：取 10 g 乙酸铅（4.3）溶于 50 mL 沸蒸馏水中，冷却放置后即为饱和乙酸铅溶液。4.6 甲醇溶液（8+2，V/V）：量取甲醇（4.4）800 mL 和 200 mL 水，混匀。4.7 黄曲霉毒素混合标准溶液：参见附录 A。4.8 黄曲霉毒素混合标准储备液：准确移取 1.0 mL 黄曲霉毒素混合标准溶液（4.7）置于 10 mL 棕色容量瓶中，以甲醇（4.4）定容至刻度，配制成黄曲霉毒素 B1、G1 浓度为 100.0 g/L，黄曲霉毒素 B2、G2 浓度为 30.0g/L 的混合标准储备液，04保存，备用，有效期为 6 个月。4.9 黄曲霉毒素混合标准工作液：准确移取适量的黄曲霉毒素混合标准储备液（4.8），用甲醇（4.4）稀释成目标浓度的黄曲霉毒素混合标准工作液，现用现配。4.10 滤膜：0.22m，有机系。4.11 纤维滤纸：孔径 1.5m。DB22/T 26942017 2 4.12 黄曲霉毒素免疫亲和柱。4.13 玻璃注射器：20 mL。4.14 具塞聚丙烯或聚四氟乙烯离心管：50 mL。5 仪器设备 5.1 液相色谱仪。5.2 天平：感量为 0.01 g。5.3 离心机：转速不低于 10 000 r/min。5.4 涡旋混合器。5.5 超声波清洗器。5.6 空气压力泵。6 样品 取有代表性的样品不低于100 g，充分混匀，置于密闭容器内。7 试验步骤 7.1 提取 称取样品1.00 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入1 g 氯化钠（4.2），加入甲醇溶液（4.6）25 mL（V1），涡旋混合1 min，超声10 min，以10 000 r/min 离心 1 min，取出上清液10 mL（V2）于另一个离心管中，加入20 mL（V3）水进行稀释，加入100 L 饱和乙酸铅溶液（4.5），涡旋混匀后10 000 r/min 离心1 min，过纤维滤纸过滤1次2次，至滤液澄清待净化。7.2 净化 免疫亲和柱内的液体流尽后，将免疫亲和柱连接于玻璃注射器（4.13）下方，准确加入上述滤液15.0 mL（V4），将空气压力泵（5.6）与玻璃注射器连接，控制滤液以不超过1滴/秒的速度通过免疫亲和柱，直至有部分空气通过柱体，用10 mL水淋洗免疫亲和柱两次，直至有部分空气通过柱体。加入1.0 mL甲醇（4.4）进行洗脱，洗脱速度不超过1滴/秒，收集全部洗脱液，加1 mL水，混匀，经滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。7.3 空白试验 除不添加样品外，采取完全相同的分析步骤进行平行操作。7.4 测定 7.4.1 色谱参考条件 色谱参考条件如下：a)色谱柱：C18，150 mm4.6 mm，5 m 或性能相当者；;b)柱温：30；c)进样量：20 L；d)流速：0.8 mL/min；DB22/T 26942017 3 e)激发波长：360 nm，发射波长：440 nm；f)衍生方式：柱后电化学衍生；g)流动相：甲醇（4.4）+水（45+55，V/V）。7.4.2 标准工作曲线 配制黄曲霉毒素B1、G1浓度为 0.25 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、4.0 g/L，黄曲霉毒素B2、G2 浓度为 0.075 g/L、0.15 g/L、0.3 g/L、0.6 g/L、1.2 g/L 的混合标准工作液，注入液相色谱仪，在上述色谱条件（7.4.1）下测定标准工作液的峰面积，以浓度与峰面积进行线性回归分析。标准溶液液相色谱图参见附录B。7.4.3 样品溶液的测定 待测样液中待测化合物的响应值应在标准曲线线性范围内，浓度超过线性范围的样品应稀释后重新进样分析。8 试验数据处理 用色谱数据处理机或按公式（1）（2）计算试样中黄曲霉毒素的含量：0()iccVXW.(1)式中：Xi 样品中被测组分含量，单位为微克每千克(g/kg)；c 从标准曲线计算得到的黄曲霉毒素浓度，单位为微克每升(g/L)；c0从标准曲线计算得到的空白试验的黄曲霉毒素浓度，单位为微克每升(g/L)；V 样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；W 最终样液所代表的样品的质量，单位为克(g)。24123()m VVWVVV （2）式中：m样品称取的质量，单位为克(g)；V1样品的提取液总体积，单位为毫升(mL)；V2稀释用样品滤液体积，单位为毫升(mL)；V3稀释液的体积，单位为毫升(mL)；V4通过免疫亲和柱的样品提取液体积，单位为毫升(mL)。计算结果保留两位有效数字。9 精密度 9.1 重复性 DB22/T 26942017 4 在同一实验室，由同一操作者使用相同设备，按相同的测试方法，并在短时间内对同一被测对象相互独立进行测试获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的 15%，以大于这两个测定值的算术平均值的 95%的情况不超过 5%为前提。9.2 再现性 在不同的实验室，由不同的操作者使用不同的设备，按相同的测试方法，对同一被测对象相互独立进行测试获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的 20%，以大于这两个测定值的算术平均值的 95%的情况不超过 5%为前提。10 试验报告 试验报告至少应给出以下几个方面的内容：a)试验对象；b)所使用的标准（包括发布或出版年号）；c)所使用的方法（如果标准中包括几个方法）；d)结果；e)观察到的异常现象；f)试验日期。DB22/T 26942017 5 A A 附 录 A（资料性附录）黄曲霉毒素混合标准溶液 黄曲霉毒素混合标准溶液见表A.1 表A.1 黄曲霉毒素混合标准溶液 标准物质名称 英文名称 分子式 CAS 号 浓度 g/L 黄曲霉毒素 B1 Aflatoxin B1 C17H12O6 1162-65-8 1000 黄曲霉毒素 B2 Aflatoxin B2 C17H14O6 7220-81-7 300 黄曲霉毒素 G1 Aflatoxin G1 C17H12O7 1165-39-5 1000 黄曲霉毒素 G2 Aflatoxin G2 C17H14O7 7241-98-7 300 DB22/T 26942017 6 B B 附 录 B（资料性附录）黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的标准溶液液相色谱图 黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的标准溶液液相色谱图见图B.1。图B.1 黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的标准溶液色谱图 _