电针预处理对脓毒症小鼠肠黏膜屏障功能保护作用及MLCK_MLC信号通路的调节作用.pdf

1092 Shanghai J Acu-mox,Oct 2023,Vol 42,No 10 文章编号:1005-0957(2023)10-1092-10 动物实验 电针预处理对脓毒症小鼠肠黏膜屏障功能保护作用及 MLCK/MLC 信号通路的调节作用 季春莲1,占靓卉2,郑静茹3,孟建标1,刘昊1,富丹婷2,庞丽莎1(1.浙江省立同德医院,杭州 310012;2.浙江省中医药研究院,杭州 310012;3.浙江中医药大学,杭州 310051)【摘要】目的 观察电针足三里穴预处理对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的脓毒症小鼠肠黏膜功能损伤的保护作用及其机制研究。方法 将 40 只美国癌症研究所(Institute of Cancer Research,ICR)小鼠随机分为正常组、模型组、电针组和非经非穴组,电针组小鼠选取足三里穴予以电针预处理,每日 1 次,每次 30 min,持续 5 d;第 5 天时采用腹腔注射 LPS 构建脓毒症肠黏膜损伤小鼠模型。通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法观察小鼠回肠组织病理学改变并评分;采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠血清中 C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、降钙素原(procalcitonin,PCT)和结肠组织中白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)表达水平;蛋白印迹(Western blot,WB)法测定结肠组织中 IL-1、IL-6、TNF-和闭合蛋白(occludin)表达的水平;免疫荧光法检测胞质紧密粘连蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)和连接蛋 白-5(claudin-5)在回肠组织的表达水平;逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)、肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)、ZO-1、claudin-5、occludin 在结肠组织中的含量。结果 电针组中因 LPS 引起细胞排列紊乱与缺失、结构破坏、腺体变形等病理损伤均有改善,电针组小鼠回肠组织病理评分明显低于模型组(P0.05),电针组小鼠结肠组织中 IL-1、IL-6 和 TNF-的含量低于模型组(P0.05)。与模型组比较,电针组小鼠血清中 CRP 和PCT 含量较低(P0.05),小鼠结肠组织中 occludin 蛋白、occludin mRNA、claudin-5 mRNA、ZO-1 mRNA 的相对表达量较高(P0.05),小鼠结肠组织中 MLCK 和 MLC mRNA 相对表达量较低(P0.05)。结论 电针足三里预处理可通过抑制炎症反应和 MLCK/MLC 信号通路上调紧密连接蛋白的表达,发挥对 LPS 诱导的脓毒症肠黏膜屏障功能损伤的保护作用。【关键词】电针;穴,足三里;脓毒症;屏障功能损伤;小鼠【中图分类号】R2-03 【文献标志码】A DOI:10.13460/j.issn.1005-0957.2023.13.3001 Protective effect of electroacupuncture pretreatment on intestinal mucosal barrier function and its regulatory effect on MLCK/MLC signaling pathway in sepsis mice JI Chunlian1,ZHAN Lianghui2,ZHENG Jingru3,MENG Jianbiao1,LIU Hao1,FU Danting2,PANG Lisha1.1.Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou 310012,China;2.Zhejiang Academy of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310012,China;3.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310051,China Abstract Objective To observe the protective effect of electroacupuncture pretreatment at Zusanli(ST36)on intestinal mucosal function in sepsis mice induced by lipopolysaccharide(LPS)and explore the mechanism.Method Forty Institute of Cancer Research(ICR)mice were randomly divided into a normal group,a model group,an 基金项目:浙江省基础公益研究计划项目(LGF20H030003)作者简介:季春莲(1974),女,副主任中医师,Email: 上海针灸杂志 2023 年 10 月第 42 卷第 10 期 1093 electroacupuncture group,and a non-acupoint group.Mice in the electroacupuncture group received electroacupuncture pretreatment at Zusanli,30 min each time,once daily for 5 d;on the 5th day,intraperitoneal injection of LPS was performed to develop sepsis models with intestinal mucosal injuries.Hematoxylin-eosin(HE)staining was used to observe and score the pathological changes in the ileum tissues.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was adopted to determine the expression levels of C-reactive protein(CRP)and procalcitonin(PCT)in the serum and interleukin-1(IL-1),interleukin-6(IL-6),and tumor necrosis factor-(TNF-)in the colon tissues.The expression levels of IL-1,IL-6,TNF-,and occludin proteins in the colon tissues were detected by Western blot(WB).The immunofluorescence method was used to determine the expression of zonula occludens-1(ZO-1)and claudin-5 in the ileum tissues.The contents of myosin light chain kinase(MLCK),myosin light chain(MLC),ZO-1,claudin-5,and occludin in the colon tissues were detected by the reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).Result The electroacupuncture group demonstrated improvements in pathological injuries caused by LPS,such as disordered cells or cell loss,damaged structure,and deformed glands;the histopathological score of the ileum tissues was notably lower in the electroacupuncture group than in the model group(P0.05).The contents of IL-1,IL-6,and TNF-in the colon tissues were lower in the electroacupuncture group than in the model group(P0.05).Compared with the model group,the serum contents of CRP and PCT were smaller in the electroacupuncture group(P0.05);the relative expression levels of occludin protein,occludin mRNA,claudin-5 mRNA,and ZO-1 mRNA in the colon tissues were higher(P0.05),and the relative expression levels of MLCK and MLC mRNA in the colon tissues were lower in the electroacupuncture group(P0.05).Conclusion By inhibiting inflammatory reactions and elevating the expression of zonula occludens in the MLCK/MLC signaling pathway,electroacupuncture pretreatment at Zusanli produces protective effects on the damaged intestinal mucosal barrier function in sepsis induced by LPS.Key words Electroacupuncture;Point,Zusanli(ST36);Sepsis;Barrier function damage;Mice 脓毒症是指由于机体感染的反应失调引起的具有致命性的器官功能障碍,约半数以上的脓毒症患者病情恶化可继发组织器官损伤并进展为脓毒性休克,引起难以纠正的循环衰竭和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)1-2。流行病学调查发现脓毒症患者每年高达 3 000 多万人并预计在未来的 20 年内将以惊人的速度增长;此外脓毒症也是重症监护病房常见的死亡原因3-4。脓毒症发生时炎症介质的释放造成肠黏膜上皮细胞水肿、细胞间固有的有效连接断裂从而导致肠道通透性增加5。肠上皮细胞受损和黏膜通透性增加又进一步诱发或加剧 MODS,因此肠道不仅是脓毒症靶器官,更是脓毒症MODS 的始动器官6-7。可见保护肠黏膜屏障功能是治疗和改善脓毒症的关键。足三里穴治疗胃肠病已有数千年历史,其穴名解释为“三理”即理上、理中及理下,意思是可治疗腹上部、中部和下部疾病,取足三里穴以通降胃之腑气以达通则不痛的目的8。课题组前期临床数据表明电针足三里穴可显著减轻脓毒症肠功能障碍患者的炎症反应并恢复肠黏膜屏障功能9。关于电针足三里穴是如何改善脓毒症诱发的肠黏膜屏障损伤仍需要进一步探究。故本研究旨在探讨电针足三里穴预处理对脓毒症肠黏膜损伤的保护作用,希望为脓毒症的治疗提供新的思路与选择。1 材料与方法 1.1 实验动物 40 只 SPF 级雄性美国癌症研究所(Institute of Cancer Research,ICR)小鼠,体质量(202)g,购于 浙 江 实 验 动 物 中 心 许 可 证 号 为SYXK(浙)2016-0022,动物合格证号为 20210510Abzz0100018953。小鼠饲养于浙江省中医药研究院动物房,环境温度 2325,湿度 70%80%,自由摄食饮水,12 h 昼夜间断照明。实验由浙江省中医 药 研 究 院 伦 理 专 业 委 员 会 批 准 进 行(伦 理号 2019-059)。1.2 主要试剂 脂多糖(Sigma,12181202);白细胞介素-11094 Shanghai J Acu-mox,Oct 2023,Vol 42,No 10 (interleukin-1,IL-1)(上海酶联免疫生物有限公司,m11063132-C)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)(上海酶联免疫生物有限公司,m1002293-C);肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)(上海酶联 免 疫 生 物 有 限 公 司,m1002095-C)、降 钙 素 原(procalcitonin,PCT)(上海酶联免疫生物有限公司,m1002192-C);C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)(上海酶联免疫生物有限公司,1038364-C);连接蛋 白-5(claudin-5)抗 体(Affinity Bioscience,AF5216);山羊抗兔免疫球蛋白 G(immunoglobulin G,IgG)(HL)(Proteintech,SA00001-2);山羊抗小鼠IgG(HL)(Affinity Bioscience,SA00001-1);-actin抗体(Proteintech,660009-1-Ig);IL-6抗体(Proteintech,66146-1-Ig);TNF-抗体(Proteintech,17590-1-AP);胞质紧密粘连蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)抗体(Proteintech,21773-1-AP);闭合蛋白(occludin)抗体(Proteintech,27260-1-AP);Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(HL)(Beyotime,P1076);BCA蛋白测定试剂盒(Beyotime,Lot No.082820210119);总RNA 提 取 试 剂(total RNA extraction reagent,TRIZOL)(Invitrogen,15596026);抗体染料法定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)预混液(Monad,MQ10601S);去基因组与逆转录组一管化三代预混液(Monad,MR05101)。1.3 分组与干预 ICR小鼠适应性喂养7 d后随机分为4组:正常组、模型组、电针组和非经非穴组,每组 10 只。电针组小鼠进行电针预处理。小鼠双下肢备皮后常规消毒,固定小鼠,选取 0.25 mm25 mm 一次性针灸针于膝关节后外侧、腓骨小头下约 3.5 mm 处选取足三里穴10,直刺进针 3 mm 左右,连接韩氏电针仪并持续 30 min(疏密波,2.5 mA,频率 2100 Hz),以小鼠双下肢出现轻微颤动且不挣扎为度;非经非穴组小鼠电针刺激足三里穴旁开5 mm处,采用同样刺激参数,其余操作同电针组;电针组和非经非穴小鼠连续干预 5 d,模型组与正常组小鼠不作干预。末次干预结束后,模型组、电针组和非经非穴小鼠腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)溶液(10 mg/mL)进行脓毒症模型制备,依据文献及前期预实验结果发现造模3 h后小鼠出现精神萎靡、竖毛等表现表明造模成功11,正常组小鼠腹腔注射相同体积生理盐水。造模 3 h 后通过眼眶取血收集小鼠血浆,后续通过离心获得上清,然后将所有小鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液30 mg/(kgbw)进行麻醉处死,收集小鼠粪便以及将小鼠结肠组织在生理盐水中洗净残留粪便,样本均置于80 冰箱储存备用,另外取末端回肠组织1 cm固定于福尔马林中,以备后续检测。1.4 指标检测 1.4.1 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和肠组织损伤评分 回肠组织固定于福尔马林溶液中 48 h 后,进行组织脱水,石蜡包埋,切片、HE 染色和中性树胶封片,最后在光学显微镜下观察回肠组织病理形态,并根据肠黏膜损伤标准12对回肠组织进行病理评分。1.4.2 酶 联 免 疫 吸 附 法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞因子表达 称取 0.1 g 左右结肠组织置于 1.5 mL EP 管中,并加入 9 倍量磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS),在 30 Hz 条件下进行超声破碎 2 min,12 000 r/min 离心 5 min,取上清用于检测 IL-1、IL-6、TNF-含量;另外取出80 冰箱中的血清样本用于检测 CRP 和 PCT。将 IL-1、IL-6、TNF-、CRP和 PCT 的 ELISA 试剂盒进行室温平衡 60 min,然后加入 50 L 待测组织上清液和 100 L 辣根过氧化物酶标记的检测抗体,并于 37 恒温箱中温育 60 min;接着弃去液体,洗板5次后每孔加入底物A和B各50 L,于 37 恒温箱中避光孵育 15 min;最后加入 50 L终止液,在 450 nm 波长处测定各孔 OD 值。1.4.3 蛋白印迹(Western blot,WB)法检测蛋白表达 称取 80 mg 左右的结肠组织置于 1.5 mL EP 管中,并 加 入9倍 量 放 射 免 疫 沉 淀 法(r a d i o immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液,用以提取组织中蛋白,利用 BCA 蛋白测定试剂盒确定蛋白浓度,在 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)凝胶中分离蛋白裂解物,通过转膜使其电转至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,在 5%脱脂牛奶中封闭 2 h 后与IL-1(1:1 000)、IL-6(1:6 000)、TNF-(1:1 000)、-actin(1:10 000)、claudin-5(1:2 000)、occludin(1:600)抗体在 4 条件下共孵育过夜,次日与二抗于室温下共孵育2 h后,利用化学发光试剂盒再进行成像检测,并利用 Image J 软件对其灰度值进行定量分上海针灸杂志 2023 年 10 月第 42 卷第 10 期 1095 析。1.4.4 逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)技术检测肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)、肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)、ZO-1、claudin-5、occludin 基因表达量 称取 50 mg 左右结肠组织置于 1.5 mL EP 管中,加入 9 倍量 TRIZOL 用以提取总 RNA,然后通过 RT-PCR试剂盒将其反转录为 cDNA,采用 SYBR Green 检测MLCK、MLC、ZO-1、claudin-5、occludin 在结肠组织中的表达,反应条件为 95 预变性 30 s,95 变性10 s,60 退火及延伸 30 s,40 个循环。然后采用 2Ct法计算个基因的相对表达量,并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为参照基因。各基因序列如表 1 所示。表 1 各检测指标引物序列 基因 Forward(5-3)Reverse(5-3)ZO-1 GCTTTAGCGAACAGAAGGAGC TTCATTTTTCCGGAGCTTCACCA occludin TGAAAGTCCACCTCCTTACAGA CCGGATAAAAAGAGTACGCTGG claudin-5 GCAAGGTGTATGAATCTGTGCT GTCAAGGTAACAAAGAGTGCCA MLCK AAGGGAGCTAGCCTAACCCAG TTGCTACGGACAATTCCAGGG MLC GGCACAACGTGGCTCTTCTAA GATTTGCAGATCCCATCCC GAPDH AGGTCGGTGTGAACGGATTTG GGGGTCGTTGATGGCAACA 1.4.5 免疫荧光法检测蛋白表达 4 m 荧光回肠组织石蜡切片经过脱蜡、水化和抗原修复后在固定液中固定 10 min,洗涤 3 次后在封闭液中封闭 60 min,然后在 4 的条件下与 ZO-1(1:1 000)和 claudin-5(1:1 000)抗体进行结合过夜,次日与荧光标记的二抗避光孵育 60 min,然后加入少量 DAPI 染色液室温放置 5 min,最后在玻片上滴加抗荧光淬灭剂后盖上玻片,在荧光显微镜下观察。1.5 统计学方法 采用 SPSS25.0 软件对各组数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料用均数标准差表示,采用单因素方差分析比较数据,进一步两两比较采用 LSD 法。以P0.05 表示差异有统计学意义。2 结果 2.1 电针预处理对脓毒症小鼠回肠组织病理学的影响 正常组小鼠肠道组织黏膜未见明显糜烂与缺失,且腺体排列规整和无炎症细胞浸润;模型组小鼠结肠组织出现细胞排列紊乱与缺失、结构被破坏、腺体变形,有显著的病理损伤;电针组小鼠回肠上皮细胞基本完整,腺体排列整齐,病理损伤较模型组有所减轻;非针非穴组小鼠回肠组织病理则与模型组小鼠相似。详见图 1。与正常组比较,模型组小鼠回肠组织病理评分显著升高(P0.05);与模型组比较,电针组小鼠回肠组织病理评分显著降低(P0.05)。详见图 2。提示电针足三里预处理可显著改善 LPS 诱导的肠黏膜组织病理损伤。图 1 4 组小鼠回肠组织 HE 染色图(HE40)1096 Shanghai J Acu-mox,Oct 2023,Vol 42,No 10 注:与正常组比较1)P0.05;与模型组比较2)P0.05。图 2 4 组小鼠回肠组织病理评分比较(xs,n10)2.2 电针预处理对脓毒症小鼠炎症因子的影响 ELISA 结果显示,与正常组比较,模型组小鼠结肠组织中 IL-1、IL-6 和 TNF-的含量显著增高 (P0.05);与模型组比较,电针组 IL-1、IL-6 和TNF-的含量降低(P0.05)。详见图 3。WB 结果显示,与正常组比较,模型组 IL-1、IL-6 和 TNF-蛋白表达显著上调(P0.05);与模型组比较,电针组 IL-1、IL-6 和 TNF-蛋白的表达明显下调(P0.05)。详见图 4 和图 5。提示电针预处理可通过降低促炎因子的表达抑制 LPS 引起的炎症反应。注:与正常组比较1)P0.05;与模型组比较2)P0.05。图 3 4 组小鼠结肠组织中 IL-1、IL-6 和 TNF-的含量比较(xs,n10)图 4 WB 检测 4 组小鼠结肠组织中 IL-1、IL-6 和 TNF-蛋白表达条带图(n10)2.3 电针预处理对脓毒症小鼠血清CRP和PCT的影响 与正常组比较,模型组小鼠血清中CRP与PCT含量显著升高(P0.05);与模型组比较,电针组血清中 CRP 与 PCT 含量明显下降(P0.05)。详见图 6。2.4 电针预处理对脓毒症小鼠紧密连接蛋白表达的影响 与正常组比较,模型组小鼠结肠组织中 occludin蛋白、occludin mRNA、claudin-5 mRNA 和 ZO-1 mRNA的相对表达量显著降低(P0.05);与模型组比较,电针组 occludin 蛋白、occludin mRNA、claudin-5 mRNA和 ZO-1 mRNA 的相对表达量显著提高(P0.05)。详见图 7 和图 8。模型组在 LPS 的作用下表达 claudin-5和 ZO-1 蛋白的蓝绿色荧光强度较正常组弱,而电针组蓝绿色荧光强度较模型组强,详见图 9 和图 10。提示电针足三里预处理可通过提高紧密连接蛋白的表达修复 LPS 引起的脓毒症肠黏膜损伤。上海针灸杂志 2023 年 10 月第 42 卷第 10 期 1097 注:与正常组比较1)P0.05;与模型组比较2)P0.05。图 5 4 组小鼠结肠组织中 IL-1、IL-6 和 TNF-蛋白表达比较(xs,n10)注:与正常组比较1)P0.05;与模型组比较2)P0.05。图 6 4 组小鼠血清 CRP 与 PCT 含量比较(xs,n10)图 7 4 组 occludin-5 蛋白条带图 注:与正常组比较1)P0.05;与模型组比较2)P0.05。图 8 4 组小鼠结肠组织中 occludin、occludin mRNA、claudin-5 mRNA 和 ZO-1 mRNA 蛋白表达比较(xs,n10)1098 Shanghai J Acu-mox,Oct 2023,Vol 42,No 10 图 9 4 组 claudin-5 免疫荧光蛋白图(40)图 10 4 组 ZO-1 的免疫荧光蛋白图(40)2.5 电针预处理对脓毒症小鼠 MLCK/MLC 信号通路的调节作用 与正常组比较,模型组小鼠MLCK 和MLC mRNA 相对表达量显著增加(P0.05);与模型组比较,电针组小鼠 MLCK 和 MLC mRNA 相对表达量显著降低(P0.05)。详见图 11。提示电针足三里预处理可下调 MLCK/MLC信号通路的表达,从而发挥肠黏膜损伤保护作用。注:与正常组比较1)P0.05;与模型组比较2)P0.05。图 11 4 组小鼠 MLCK 和 MLC mRNA 相对表达量(xs,n10)上海针灸杂志 2023 年 10 月第 42 卷第 10 期 1099 3 讨论 脓毒症是一种机体对感染的反应失调导致的多器官功能障碍综合征(MODS),具有高发病率和死亡率13。由于胃肠道是 MODS 的始动器官,因此肠黏膜屏障功能在脓毒症发生发展过程中的作用早已引起广泛的关注14。目前临床针对肠黏膜功能的保护措施主要有益生菌、谷氨酰胺和肠黏膜保护剂等,但是脓毒症患者由于肠黏膜屏障功能损伤较重造成胃肠动力差,胃肠内给药容易出现潴留、腹泻,增加误吸风险等,效果均不尽如人意15。而足三里穴作为治疗胃肠疾病的经典穴和首选穴,在治疗脓毒症肠黏膜屏障功能损伤中具有明显的优势。因此本实验通过建立 LPS 诱导的脓毒症肠黏膜屏障功能损伤模型探讨了电针足三里预处理对其的治疗作用及潜在机制。实验数据表明电针足三里显著减轻脓毒症肠黏膜病理损伤和肠道炎症反应,并且可通过抑制 MLCK/MLC 信号通路上调紧密连接蛋白的表达修复肠黏膜屏障功能。炎症失衡是脓毒症发病的关键基础,当机体发生脓毒症时肠道内的革兰氏阴性菌细胞壁会占据主导地位,而其主要成分 LPS 会刺激单核细胞或巨噬细胞产生 IL-1、IL-6、TNF-等一系列促炎因子,引发炎症风暴16-17。CHEN L 等18的研究表明在脓毒症模型中促炎因子显著增加,在引发炎症反应的同时也导致了肠源性感染。本实验数据也表明模型组小鼠肠组织中的上述促炎因子表达明显升高,肠黏膜也有明显的病理损伤。此外,临床研究表明电针足三里可减轻脓毒症患者的炎症反应,改善其肠功能障碍19。本研究中电针足三里的预处理不仅显著逆转了这些细胞因子的变化并且也减轻了 LPS 引起的肠黏膜组织损伤,这表明电针足三里可通过降低炎症反应保护脓毒症肠黏膜屏障损伤。CRP和PCT作为响应炎症反应而产生的蛋白质,一直以来也是临床诊断脓毒症的关键指标和生物标志物20。CRP 是在肝脏中被 IL-6 上调合成的蛋白质,在脓毒症急性炎症期间显著升高,可通过与微生物磷脂成分结合而促进巨噬细胞将其清除21。PCT 是在 LPS等内源性和外源性刺激下分泌的急性期蛋白,在脓毒症感染期间比其他炎症因子更早作为临床诊断标志物22。本实验结果也发现模型组小鼠在 LPS 的刺激下血清中PCT和CRP水平急剧上升,但是电针足三里逆转了其水平的增加。这进一步说明了电针足三里对脓毒症急性期引发的炎症风暴有显著的调控作用。脓毒症肠黏膜屏障功能损伤一直被认为引发全身炎症反应启动的关键环节23。肠道紧密连接蛋白的破坏是导致肠道通透性增加、肠黏膜屏障损伤和功能障碍的主要原因之一24。紧密连接蛋白由 ZO-1、occludin 和 claudin 组成,ZO-1 是一种可调控肠上皮细胞紧密连接蛋白的组装和逆转细胞间连接蛋白表达而对肠道通透性产生影响的支架蛋白25。occludin 则是一种可与 ZO-1 连接的跨膜蛋白,其水平的改变可反映肠黏膜屏障破坏的程度,且有研究表明在肠上皮细胞系和动物模型中其表达的增加有助于肠黏膜屏障功能损伤的修复26。claudin-5 通过形成紧密连接蛋白链在肠上皮细胞间形成屏障,当其异常表达时会导致肠上皮结构损伤和功能障碍,引发肠上皮细胞间隙通透性增加,最终使得 LPS 等物质透过肠黏膜屏障进入体循环导致脓毒症的发生27。在本研究中发现模型组小鼠ZO-1、occludin和claudin-5的表达均显著降低,相比之下电针足三里组小鼠紧密连接蛋白的表达有明显的逆转。这表明电针足三里可通过上调紧密连接蛋白的表达修复脓毒症肠黏膜损伤屏障并防止脓毒症进一步恶化。研究表明 MLCK 是调控紧密连接蛋白的关键物质,当MLCK启动转录后增加MLCK蛋白的表达,又进一步促进 MLC 的激活,这促使了 ZO-1、occludin 和 claudin-5等紧密连接蛋白的重新分布,导致肠黏膜屏障损伤28。YE X等29证明抑制 MLCK/MLC 信号通路的激活可增强紧密连接蛋白的表达从而抑制肠道通透性增加。本研究为进一步探究电针足三里对紧密连接蛋白的调控机制,对 MLCK/MLC 信号通路进行检测发现电针足三里抑制了 LPS 引起的 MLCK 和 MLC 的激活,提示该信号通路可能是电针足三里发挥肠黏膜屏障损伤保护作用的关键机制。综上所述,电针足三里预处理可通过抑制炎症因子(IL-1、IL-6、TNF-)的分泌和上调紧密连接蛋白(ZO-1、occludin 和 claudin-5)的表达发挥对 LPS 诱导的脓毒症肠黏膜屏障功能损伤的保护作用,其调控机制可能与 MLCK/MLC 信号通路有关。但是本实验仍存在一定的缺陷,后续需对肠道损伤引发的细菌易位以及 MLCK/MLC 信号通路进行深入研究,并进一步探讨非经非穴部位在脓毒症发展过程中的作用。1100 Shanghai J Acu-mox,Oct 2023,Vol 42,No 10 参考文献 1 VINCENT J L,RELLO J,MARSHALL J,et al.Inter-national study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care unitsJ.JAMA,2009,302(21):2323-2329.2 FLEISCHMANN C,SCHERAG A,ADHIKARI N K,et al.Assessment of global incidence and mortality of hospital-treated sepsis.current estimates and limitationsJ.Am J Respir Crit Care Med,2016,193(3):259-272.3 GIUSTOZZI M,EHRLINDER H,BONGIOVANNI D,et al.Coagulopathy and sepsis:Pathophysiology,clinical manifestations and treatmentJ.Blood Rev,2021,50:100864.4 PREST J,SATHANANTHAN M,JEGANATHAN N.Current trends in sepsis-related mortality in the United StatesJ.Crit Care Med,2021,49(8):1276-1284.5 SUBRAMANIAN S,GENG H,TAN X D.Cell death of intestinal epithelial cells in intestinal diseasesJ.Sheng Li Xue Bao,2020,72(3):308-324.6 PERNER A,RHODES A,VENKATESH B,et al.Sepsis:frontiers in supportive care,organisation and researchJ.Intensive Care Med,2017,43(4):496-508.7 FAY K T,FORD M L,Coopersmith C M.The intestinal microenvironment in sepsisJ.Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis,2017,1863(10):2574-2583.8 张晓英.足三里穴在消化系统中的临床应用J.内蒙古中医药,2013,32(23):33.9 孟建标,季春莲,许秀娟,等.电针足三里联合大承气汤敷脐对脓毒症患者肠屏障功能的保护作用J.中国中西医结合杂志,2018,38(9):1062-1067.10 李辞蓉,宋大鲁.小鼠常用针灸穴位J.实验动物与动物实验,1992,12(2):3.11 ZHAN L,PU J,ZHENG J,et al.Tetrastigma hemsle-yanum Diels et Gilg ameliorates lipopolysaccharide induced sepsis via repairing the intestinal mucosal barrierJ.Biomed Pharmacother,2022,148:112741.12 王海庆,欧阳军.不同液体复苏对失血性休克大鼠肠粘膜的影响J.现代生物医学进展,2011,11(3):441-443.13 ZOU Z,LIU B,ZENG L,et al.Cx43 Inhibition attenuates sepsis-induced intestinal injury via downregu-lating ROS transfer and the activation of the JNK1/Sirt1/FoxO3a signaling pathwayJ.Mediators Inflamm,2019,2019:7854389.14 CARRICO C J,MEAKINS J L,MARSHALL J C,et al.Multiple-organ-failure syndromeJ.Arch Surg,1986,121(2):196-208.15 金丽美,孟建标.益生菌联合早期肠内营养对脓毒症患者炎症反应及免疫功能的影响J.中国现代医生,2018,56(30):10-12.16 ULEVITCH R J,TOBIAS P S.R