碘对甲状腺细胞组蛋白甲基化修饰的影响.pdf

宁夏医学杂志2 0 2 3年10 月第45卷第10 期Ningxia Med J,Oct.2023,Vol.45,No.10Doi:10.13621/j.1001-5949.2023.10.0871871:论著碘对甲状腺细胞组蛋白甲基化修饰的影响路晰煊,雷红,徐礼,梁海艳,周小莉,沙立萍【摘要目的从表观遗传的角度探讨碘对甲状腺疾病的影响,分析碘化钠作用于甲状腺细胞后组蛋白甲基化及相关修饰酶的变化。方法用不同浓度碘化钠(1M,10 M,100 M,1mM,10mM)刺激甲状腺细胞系N-thy-ori-3-1后,通过蛋白质印迹法和荧光定量PCR检测了蛋白表达和转录水平。结果不同浓度碘化钠作用于甲状腺细胞后引起细胞组蛋白H3赖氨酸4的三甲基化(H3K4me3）整体蛋白水平的升高,同时组蛋白H3赖氨酸2 7 的三甲基化(H3K27me3）整体蛋白水平下降，二者变化呈相反趋势,H3K4me3总蛋白随着碘化钠浓度升高逐渐增高,并随着时间动态改变,同时碘化钠能诱导升高相关甲基化转移酶MLL1 和去甲基化转移酶JMJD3的转录表达和蛋白水平。结论碘能诱导甲状腺细胞整体H3K4me3蛋白的表达增加和H3K27me3蛋白的表达减少,伴随MLL1和JMJD3的表达增加，为进一步探讨高碘与甲状腺自身免疫的机制研究提供了表观学的研究基础。【关键词 碘；组蛋白甲基化；表观遗传；甲状腺【中图分类号 R581.4Changes of histone methylation modification in thyroid cells induced by iodineLU Xixuan,LEI Hong,XU Li,LIANG Haiyan,ZHOU Xiaoli,SHA Liping.Department of Endocrinology,Cardiovascular and Cerebro-vascular Disease Hospital,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750002,ChinaCorresponding author:LEI Hong,Email:2236246662 Abstract Objective To explore the effects of iodine on thyroid diseases from the perspective of epigenetic inheritance,and an-alyze the changes of histone methylation and related modifying enzymes after the action of sodium iodide on thyroid cells.Methods Af-ter stimulating thyroid cell line N-thy-ori3-1 with dfferent concentrations of sodium iodide(1 M,10 M,100 M,1 mM,10mM),the expression levels of protein and mRNA were detected by western blotting and RT-PCR.Results The overall protein level oftrimethylated histone H3 lysine 4(H3K4me3)in thyroid cells increased after the different concentrations of sodium iodide,while the to-tal protein level of trimethylated histone H3 lysine 27(H3K27me3)decreased.The two changes showed a transient opposite trend.Thetotal protein of H3K4me3 increased gradually with the increase of sodium iodide concentration,and dynamically changed with time.At thesame time,sodium iodide could increase the expression levels of mRNA and protein of related methyltransferases MLL1 and demethyl-transferase JMJD3.Conclusion Iodine can increase the level of H3K4me3 and decrease the level of H3K27me3 in thyroid cells,accom-panied by an increase in the expression of MLLI and JMJD3,which provides an epigenetic basis for further exploring the mechanism of i-odine on thyroid autoimmunity.Key words Iodine;Histone methylation;Epigenetic;Thyroid碘是人体必不可少的微量元素。碘原子是一种电子供体，作为还原剂发挥作用，可被特异性过氧化物酶如甲状腺过氧化物酶氧化,形成甲状腺激素（T H s），对人体正常代谢和生长发育至关重要。组蛋白甲基化修饰是表观遗传修饰的调节机制之一,近年来得到越来越多的关注。组蛋白不同氨基酸上的不同甲基化数目能够调控基因转录,并广泛参与细胞发育、调亡、代谢、炎症反应及免疫应答等生物过程。组蛋白甲基化的形成主要依靠甲基化转移酶通过将甲基供体S一腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到其作用的组蛋白上来完成。在脊椎动物中,组【基金项目】宁夏自然科学基金项目（2 0 2 0 AAC03424）【作者单位】宁夏医科大学总医院心脑血管病医院内分泌科，宁夏银川7 50 0 0 2【作者简介 路晰嬉（198 6 一），女，硕士研究生，副主任医师，主要从事碘和甲状腺相关研究。【通信作者】雷红，主任医师,Email:【文献标识码 A蛋白H3赖氨酸4三甲基化（H3K4me3）特异性位于ORF的5 端,被认为是基因活化的标志,其形成需要经过H3K4 甲基化转移酶的转甲基作用2 ,混合谱系白血病（MLL）家族蛋白（MLL14，SET 1A，SET1B)则是负责H3K4甲基化最主要的蛋白3。组蛋白3赖氨酸2 7 三甲基化(H3K27me3)位于基因启动子区通常被认为是转录抑制的标志，可被赖氨酸特异性去甲基化（KDM）家族的KDM6B（又名含D3蛋白Jumonji结构,JJMJD3）和KDM6A作用发生去甲基化,引起基因转录激活41。既往有大量的研究探索了碘营养和甲状腺疾病的关系，但少有分析碘对甲状腺细胞组蛋白甲基化的影响机制。本研究主要分析碘作用于人甲状腺细胞系后对H3K4me3和H3K27me3及相应甲基化转移酶的影响,从表观遗传学方面去探究碘影响甲状腺的潜在机制。872.1资料与方法1.1一般资料:人正常甲状腺上皮细胞系N-thy-ori-3-1 由中国医科大学内分泌研究所捐赠。细胞培养于含有10%胎牛血清（Gibco，美国），以及1%青霉素链霉素的RPMI 1640培养基（Invitro-gen,美国)中，置于37,5%CO,环境中培养,隔天换液,弃去上清液和未贴壁的死细胞，更换培养基，培养4 6 d,细胞贴壁7 0%8 0%后将细胞接种于6孔板中,同时设定2 个复孔,利用不同剂量（1M、10 M、10 0 M、1 m M、10 m M）的碘化钠(Sigma,美国)分别刺激甲状腺细胞6 h和2 4 h。1.2Real time-PCR:细胞中加人 Trizol 溶液（In-vitrogen,美国），根据试剂要求提取细胞RNA,检测RNA纯度和浓度，使用TAKARA反转录试剂盒按照说明在反转录仪器中进行反转录得到 cDNA,在罗氏LightCycler 480 Real-Time PCR仪器中进行分析。2-AACi法进行相对定量分析，所有目的基因均以GAPDH为内参,最终定量=目的基因定量/GAPDH定量。引物序列如下,MLL1上游序列为3GAG-GACCCCGGATTAAACAT5，下游序列为3GGAGCAAGAGGTTCAGCATC-5;MLL2上游序列为3AACCATATCGGCCTGGCATT5，下游序列为3-CAGGCAGGTCAGCAGGTATC-5;MLL3上游序列为3-TGGTACTGACACTTCACAGGC-5，下游序列为3一ACCCGGTAGGACAAATACTGG5;MLL4 上游序列为 3AACCATATCGGCCTG-GCATT5，下游序列为 3CAGGCAGGTCAG-CAGGTATC-5;SET7/9上游序列为3-GGCCG-GTCCATTCAGCTCTCC 5，下游序列为3GCAGGGCCAGGGCGTTTACA5；A SH 1L上游序列为3AGTTTGCCCCCTTTAGCCTT5，下游序列为3-CGATGAGAGTGCAGGGAAGT-5;JMJD3上游序列为3-GCAGGAATGCCAAGGTGAAAG-5，下游序列为3GCAGCAGGACAGGTGAGAAGG-5;GAPDH 上游序列为 3-TGACAACTTTG-GTATCGTGGAAGG5，下游序列为 3 AG-GCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-5。1.3蛋白质印迹法（Westernblot，W B）：根据蛋白提取试剂盒(凯基,中国)步骤提取细胞蛋白。用10 0 L裂解缓冲液将培养的细胞置于冰上裂解,用细胞刮板收集，进行涡旋震荡，于4、12 0 0 0 r/min离心10 min。收集上清液,利用蛋白定量试剂盒（碧云天，中国)进行蛋白定量。将定量蛋白煮沸,分别在6%和12%凝胶上进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。将凝胶转移到聚乙烯膜上，（M i lli p o r e,美国）,封闭2 h,用抗体antiH 3K 4m e 3(Abcam,美国）,anti-H3K27me3（A b c a m）和 anti-actin(Abcam)在 4下孵育,过夜,室温下与 HRP宁夏医学杂志2 0 2 3年10 月第45卷第10 期Ningxia Med J,Oct.2023,Vol.45,No.10标记的IgG抗体孵育2 h。采用化学发光底物（Ther-mo Fisher,美国）检测特异性条带。使用 Image-ProPlus对相关的免疫印迹条带进行定量分析。1.4统计学方法：采用SPSS20.0统计软件,计量资料以xs表示，组间采用单因素方差分析和t检验分析,以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1不同浓度碘刺激甲状腺细胞系 N-thy-ori-3-1后细胞组蛋白H3K4me3的变化：甲状腺细胞H3K4me3蛋白水平随着高碘浓度增加而增加,在高浓度（10 0 M、1 m M 和10 mM）的碘化钠作用下H3K4me3整体蛋白水平显著升高。随着时间延长，在刺激2 4 h 后,甲状腺细胞H3K4me3整体蛋白的水平随着碘化钠的刺激逐渐下降,呈动态变化，见图1(封二)。2.2组蛋白H3K4me3甲基化转移酶在不同浓碘浓度刺激下的表达：碘化钠作用于甲状腺细胞6 h，使得细胞组蛋白甲基化转移酶 MLL1 和 MLL2 的 mR-NA水平显著升高,2 4 h 后碘化钠仍能诱导 MLL1 的转录表达增高,其他甲基化转移酶在碘化钠刺激下并无改变，见图2（封二）。2.3不同浓度碘刺激甲状腺细胞系 N-thy-ori-3-1后细胞组蛋白H3K27me3的变化：随着碘化钠浓度的升高,H3K27me3总蛋白水平呈减少趋势,尤其是在1 mM 和10 mM 碘化钠刺激下,H3K27me3整体蛋白水平显著下降，随着时间延长至2 4h后，H3K27me3整体蛋白水平较6 h 升高明显,但仍有随着碘浓度升高而下降的趋势,与6 h的结果一致,见图3(封二)。2.4碘化钠促进甲状腺细胞高表达JMJD3:高浓度碘化钠(1 mM)能诱导甲状腺细胞JMJD3 的转录水平增加,接下来的 WB 实验验证了 JMJD3 的蛋白表达在1mM的碘化钠刺激下呈一致性升高,见图4(封二)。3讨论本研究通过细胞实验探究了碘作用于甲状腺细胞引起的组蛋白甲基化及相关修饰酶的变化,发现浓度梯度碘作用于甲状腺细胞系后能够引起细胞整体H3K4me3蛋白量逐渐增加,而H3K27me3蛋白量则逐渐下降，同时H3K4me3 转移酶 MLL1，以及H3K27me3 去甲基化转移酶 JMJD3 表达显著增加。碘作为甲状腺激素合成最基础和最重要的元素,其与甲状腺疾病的发生有着紧密联系。机体内合适的碘营养状态对甲状腺的功能稳定尤为重要。碘不足和碘过量均可以导致甲状腺疾病的发生，如甲状腺肿、妊娠不良结局、甲状腺功能减退症、甲状腺功能亢进症及自身免疫性甲状腺炎等5-7 。既往有大量流行病学研究发现高碘可能导致甲状腺自身免疫风险的增加。有研究提示8 ，碘超足量地区和宁夏医学杂志2 0 2 3年10 月第45卷第10 期Ningxia Med J,Oct.2023,Vol.45,No.10碘过量地区桥本甲状腺炎的累积发病率分别升高4.4倍和5.5倍。国外的研究显示实行食盐加碘政策后甲状腺自身抗体和桥本甲状腺炎患病率明显提高9。许多基础实验研究也证实了碘在桥本甲状腺炎中的重要作用。经典模型就是0.0 5%碘化钠饮水能诱导 NOD.H-2h4小鼠发生自发性桥本甲状腺炎,而减少碘水喂养可减轻甲状腺炎的发生10 碘过量引起甲状腺自身免疫的具体机制尚不完全明晰,在表观遗传研究方面更是稀缺。组蛋白甲基化是表观遗传修饰中非常重要的调控机制。组蛋白H3K4me3 位于转录起始位点标志着基因转录活化,启动子区域H3K4me3的水平以及不同的分布宽度都和基因转录紧密相关 。甲状腺细胞作为自身免疫攻击的靶细胞,有研究报道其本身也能被碘诱导表达许多细胞因子和黏附分子，包括细胞间黏附分子1（I CA M-1）,CC基序趋化因子配体2（CCL2）,CX C 基序趋化因子配体10(（CXCL10)等12-13,参与自身免疫性甲状腺炎的发生及发展中。研究发现桥本甲状腺炎患者甲状腺滤泡细胞 CXCL8、CCL2 和 ICAM1 基因启动子区域H3K4me3富集明显增加,并伴ICAM1、CCL2 和 CXCL8 的表达显著增加,同时桥本甲状腺炎患者甲状腺组织高表达H3K4me3甲基化转移酶MLL114。本研究结果提示碘能增加甲状腺细胞整体H3K4me3水平,同时能刺激甲状腺细胞MLL1转录表达增加,这一发现间接为进一步探究碘是否通过影响甲状腺细胞H3K4me3的改变而促使桥本甲状腺炎提供了表观学依据。本研究的另外一个发现是碘也能影响H3K27me3的整体甲基化水平及JMJD3的表达。JMJD3通过转甲基作用特异性去除启动子区域H3K27me3 的甲基从而解除对基因的转录抑制15。大量研究发现 H3K27me3和 JMJD3与自身免疫疾病相关,JMJD3 在调控免疫中发挥重要的作用。在系统性硬化疾病的患者中,JMJD3 在 CD4+T 细胞中呈明显的表达升高,同时相应伴有 H3K27me3显著下降16 。在一项类风湿关节炎（RA)的研究中,半胱氨酸生成酶能减少RA患者关节成纤维细胞JMJD3的表达,从而减少抑制白介素1(IL1)诱导下的炎症因子表达。沉默JMJD3 基因或者用 JMJD3特异性抑制剂干预则能调控基因启动子区 H3K27me3 的水平进而显著抑制IL-1诱导下的成纤维细胞的炎症因子水平17 。体内研究也表明抑制JMJD3 能显著减缓胶原诱导小鼠关节炎模型的类风湿关节炎症状17 。另一项研究发现JMJD3活性被抑制后能够减少前炎症因子IL-1 等刺激下的胰岛细胞表达趋化因子CCL2和炎症因子18 。研究显示桥本甲状腺炎患者甲状腺组织高表达 JMJD3,CCL2和 CX-873CL10,利用肿瘤坏死因子(TNF-)诱导甲状腺炎模型后,发现JMJD3抑制剂能显著减少TNF-诱导下的炎症因子 CCL2 和 CXCL10 的表达19。本研究发现高碘能诱导甲状腺细胞高表达JMJD3伴随H3K27me3整体蛋白的改变，为探讨碘对桥本甲状腺炎表观遗传影响提供了部分证据。但本研究仅探讨了甲状腺细胞整体甲基化的改变,缺乏对特定基因启动子组蛋白甲基化丰度的研究，未来仍需要通过免疫共沉淀测序等方法评估全基因启动子H3K4me3 和H3K27me3的分布,更深人地分析碘对甲状腺细胞表观修饰的影响。综上所述,本研究通过体外实验探讨了碘对甲状腺细胞的组蛋白甲基化影响,发现碘作用于甲状腺细胞使得细胞整体H3K4me3 的表达增加和 H3K27me3的表达减少,伴随 MLL1 和 JMJD3的表达增加。这为进一步探讨高碘与甲状腺自身免疫的机制研究提供了表观学的研究基础和靶向治疗的新思路。参考文献1 DE LA VIEJA A,SANTISTEBAN P.Role of iodide metabolism inphysiology and cancer J.Endocrine-Related Cancer,2018,25(4):R225 R245.2VERMEULEN M,TIMMERS H T.Grasping trimethylation of his-tone H3 at lysine 4J.Epigenomics,2010,2(3):395-406.3WANG P F,LIN C Q,SMITH E R,et al.Global analysis of H3K4methylation defines MLL family member targets and points to a rolefor MLL1-mediated H3K4 methylation in the regulation of tran-scriptional initiation by RNA polymerase I J.Molecular and Cel-lular Biology,2009,29(22):6074-6085.4RAO R C,DOU Y L.Hijacked in cancer:the 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32.18）m。与治疗前相比，治疗后1个月、2 个月、3个月及6 个月的CMT值均有下降,差异均有统计学意义(P0.05)。与治疗前CNV面积(0.490.43)mm相比,治疗后1个月为（0.42 0.30）m m 2个月为（0.42 0.2 5）mm3个月为（0.410.36）mm6个月为（0.430.2 2）mm，患眼CNV面积明显下降,差异均有统计学意义(P0.05）。结论康柏西普玻璃体腔注射治疗PM-CNV效果显著、安全性高,OCTA具有无创、快速的优点，可以进行病情评估并指导临床治疗,为PM-CNV的诊治提供临床依据。【关键词光学相于断层扫描血管造影；康柏西普；病理性近视；脉络膜新生血管中图分类号 R774.5Application of OCTA in intravitreal injection of conbercept in the treatment of pathological myopiaIZhnA HuiMA RuninNingia ye Hopial,Ples Hospal of Ningia Hui Auonomous Ron,Yinch750002,China;2.The Third Clinical College Afiliated to Ningxia Medical University,Yinchuan 750002,ChinaAbstract Objective To evaluate the clinical effect of intravitreal injection of conbercept in the treatment of pathological myo-pia accompanied with choroidal neovascularization(PM-CNV)by optical coherence tomography angiography(OCTA).Methods 30cases of PM-CNV treated by intravitreal injection of conbercept were retrospective analyzed.All patients were received 3+PRN treat-ment by intravitreal injection of 0.05 mL of conbercept(including 0.5 mg conbercept).The examinations of OCT and OCTA were11 CHEN K,CHEN Z,WU D Y,et al.Broad H3K4me3 is associated with increased transcription elongation and enhancer activity attumor-suppressor genes J.Nature Genetics,2015,47(10):1149 1157.12ANTONELLI A,FERRARI S M,GIUGGIOLI D,et al.Chemokine(C-X-C motif)ligand(CXCL)10 in autoimmune diseases J.Autoimmunity Reviews,2014,13(3):272-280.13AJJAN R A,WEETMAN A P.Cytokines in thyroid autoimmunityJ.Autoimmunity,2003,36(6/7):351-359.14 LU X X,SUN J,LIU T,et al.Changes in histone H3 lysine 4 trim-ethylation in hashimotos thyroiditis J.Archives of Medical Sci-ence,2022,18(1):153-163.15 HONG S,CHO Y W,YU L R,et al.Identification of JMJC domain【基金项目 白求恩朗沐中青年眼科科研基金项目（BJLM2021003J）【作者单位 1.宁夏回族自治区人民医院宁夏眼科医院,宁夏银川7 50 0 0 22.宁夏医科大学附属第三临床学院，宁夏银川7 50 0 0 2【作者简介 李贞（198 9一），女，硕士研究生，主治医师，主要从事眼底疾病的临床研究。通信作者马润清，副主任医师,Email:文献标识码 Aaccompanied with choroidal neovascularization-containing UTX and JMJD3 as histone H3 lysine 27 demethy-lasesJ.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,2007,104(47):18439-18444.16WANG Q,XIAO Y F,SHI Y Q,et al.Overexpression of JMJD3May contribute to demethylation of H3K27me3 in CD4+T cellsfrom patients with systemic sclerosis J.Clinical Immunology,2015,161(2):396 399.17WU W J,QIN M,JIA W W,et al.Cystathionine-lyase amel-iorates the histone demethylase JMJD3-mediated autoimmune re-sponse in rheumatoid arthritisJ.Cellular&Molecular Immunol-0gy,2019,16(8):694-705.18BACKE M B,ANDERSSON J L,BACOS K,et al.Lysine demethylaseinhibition protects pancreatic cells from apoptosis and improves -cell functionJ.Mol Cell Endocrinol,2018,460:47-56.19 LU X X,LIU Y,XU Li,et al.Role of jumonji domain-containingprotein D3 and its inhibitor GSK-J4 in hashimotos thyroiditisJ.Open Med,2023,18(1):20230659.收稿日期 2 0 2 3-0 4 18责任编辑 李洁Doi:10.13621/j.1001-5949.2023.10.0871碘化钠6hCon 1uM 10 uM100uM1mM 10mM Con 1uM 10 uM100uM1mM 10mMH3K4me3碘化钠24h-actin图1浓度梯度碘作用于甲状腺细胞后组蛋白H3K4me3的变化abml1mll20.020r0.020T0.015F0.015F0.0100.010F0.0050.005f0.0000.000mll10.020r0.015F0.0100.0050.000mll20.0200.0150.0100.0050.000LmIl130.010r0.0080.006F0.0040.0020.000mI40.0008uojseudxe sApejal0.00060.00040.00020.000mI130.010r0.0080.0060.0040.0020.000mll40.0008r0.00060.040.00020.0000ash1l0.0040.0030.0020.0010.000注：a.1mmol碘化钠刺激甲状腺细胞6 h后，H3K4me3组蛋白甲基化转移酶的mRNA水平。b.1mmol碘化钠刺激set7I90.0000200.0000150.0000100.0000050.000000对照组治疗组甲状腺细胞2 4h后，H3K4me3组蛋白甲基化转移酶的mRNA水平。图2 碘作用于甲状腺细胞后H3K4me3甲基化转移酶的转录水平ash110.0060.0040.0020.000set7/90.000150.000100.000050.00000对照组治疗组碘化钠6h-ConluM10uM100uMImM10mMCon1uM10uM100uM1mM10mMH3K27me3碘化钠24h碘化钠ConluM10uM100uM1mM10mMJMJD3-actin-actin图3浓度梯度碘作用于甲状腺细胞后组蛋白H3K27me3的变化图4高碘作用于甲状腺细胞后JMJD3的改变