代谢调节与代谢工程.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,代谢调节与代谢工程,代谢调节与代谢工程,第1页,微生物代谢特点,:,微生物在长久进化过程中，形成了一整套完善代谢调整系统，以确保各种代谢活动经济而高效地进行。,微生物代谢生化反应通常是十分复杂而快速，需要非常协调进行。,微生物含有快速适应外界环境改变能力，经过开启或关闭相关代谢路径，平衡代谢产物和反应速率来适应环境。,所以，微生物代谢是受高度调整。,微生物代谢高度调整证据：,全部大分子单体,(,前体，如氨基酸,),合成速率同大分子,(,如蛋白质,),合成速率协调一致，不会浪费能量去合成那些它们用不着东西；,任何一个单体合成，如能从外源取得并能进入细胞内，单体合成自动中止，参加这些单体生成酶合成也会停顿；,只有在一些有机基质,(,如乳糖,),存在时，才会合成异化这些基质酶；,存在两种有机基质，微生物会先合成那些能异化、更易利用基质酶，待易利用基质耗竭，才开始诱导分解较难利用基质酶；,养分影响生长速率，从而对应改变细胞大分子组成,(,如,RNA,含量,),。,微生物代谢调整,代谢调节与代谢工程,第2页,微生物代谢机构示意图,代谢调节与代谢工程,第3页,主讲内容,3.1,酶活性调整,3.2,酶合成调整,3.3,代谢调整,3.4,代谢工程,代谢调节与代谢工程,第4页,3.1,酶活性调整,3.1.1,代谢控制部位,代谢调节与代谢工程,第5页,微生物细胞代谢调整方式：,可调整营养物质透过细胞膜而进入细胞能力；,经过酶定位以限制它与对应底物靠近；,调整代谢流，该调整方式最为主要，它包含调整酶合成量和调整现成酶分子催化活力。,代谢调节与代谢工程,第6页,3.1.2,调整方法,1.,定义：,蛋白质分子中一个或者多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或者解开，使其活性改变作用。,2.,化学基团：,磷酸基、甲基、乙基、腺苷酰基。,蛋白质共价部位：,氨基酸残基上羟基,。,3.,分类,：,可逆、不可逆。,共价修饰,代谢调节与代谢工程,第7页,1,、可逆共价修饰,大多数共价调整是经过特定部位丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸侧链（,-OH,）磷酸化和去磷酸化来调整。,磷酸化酶,意义：,短时间经信号开启，触,发生成大量活性酶。,更轻易控制酶活性以,响应环境代谢。,代谢调节与代谢工程,第8页,酶原：,必须在一定条件下，去掉一个或者几个特殊肽键，从而使酶构象发生一定改变才有活性。,2,、不可逆共价修饰,如：胰蛋白酶原活化,是靠,N-,除去一个己肽。,代谢调节与代谢工程,第9页,名称,：,变构效应,/,别构效应,/,副位效应,定义：,是指一个,小分子物质,与一个,蛋白质分子,发生,可逆相互作用,，造成这种,蛋白质构象发生改变,，从而,改变,这种蛋白质,与第三种分子相互作用。,别构酶：,含有别构作用酶成为,变构酶。,变构控制,代谢调节与代谢工程,第10页,协同作用,定义：,是指酶蛋白分子,一个位点与配基结合,会,影响,该酶蛋白,另一个位点与基质结合。,正向协同作用：,起始配基结合,促进,酶蛋白分子另一个位置更多基质结合。,负向协同作用：,这种结合使深入结合,受阻。,代谢调节与代谢工程,第11页,第一个酶,（有活性）,第一个酶,（无活性）,终产物,终产物（调整物）,结合在调整中心,代谢调节与代谢工程,第12页,缔合与解离,能进行这种转变蛋白质由多个亚基组成，蛋白质活化与钝化是经过组成它亚基单位缔合与解离实现。这类相互转变钝化是由共价修饰或若干配基缔合开启。,竞争性抑制,一些蛋白质生物活性受代谢物竞争性抑制。,其它调整方式,代谢调节与代谢工程,第13页,酶合成调整：,主要指经过调整酶合成量来控制微生物,代谢速度 调整机制。这类调整是在,基因水平,（原核生物主要在转录水平上）,上进行。,酶诱导,方式,分解代谢物阻遏,终产物调整,3.2,酶合成调整,凡能促进酶合成,现象称诱导。,妨碍酶合成现象称阻遏。,代谢调节与代谢工程,第14页,1,、诱导作用,定义：,培养基中某种基质与微生物接触而增加（诱导）细胞中其对应酶合成速度。,类型：,按照酶合成与环境影响关系来分，若酶合成速度受基质浓度改变影响很小，这种酶称为,组成酶,，反之，称为,诱导酶,。,代谢调节与代谢工程,第15页,概念：,诱导物：,是指能起诱导作用化合物。,抚慰诱导物：,酶基质结构类似物，它们不能作基质被酶转化，却,是出众诱导物。,诱导作用分子机制：,Jacob,与,Monod,最先提出诱导作用模型，也叫操纵子模型。,操纵子,是一组功效上相关基因，由,开启基因,（,Promoter,）、,操纵基因,（,Operater,）、,结构基因,（,Structural gene,）三个别组成。,另外，,调整基因,主要是合成阻遏物,代谢调节与代谢工程,第16页,代谢调节与代谢工程,第17页,乙酰基转移酶,半乳糖苷,透性酶,-,半乳糖苷酶,操作位点,乳糖操纵元,结构,调整基因,代谢调节与代谢工程,第18页,Z,、,Y,、,A,是指结构基因，用于表示性状,lacZ,编码,-,半乳糖苷酶，此酶由,500kd,四聚体组成，它能够切断乳糖半乳糖苷键，而产生半乳糖和葡萄糖,lacY,编码,二分之一乳糖苷透性酶，这种酶是一个分子量为,30kDd,膜结合蛋白，它组成转运系统，将半乳糖苷运入到细胞中。,lacA,编码,-,半乳糖苷乙酰转移酶，其功效只将乙酰,-,辅酶,A,上乙酰基转移到,-,半乳糖苷上。,该酶不参加乳糖代谢！,生理意义：在细胞中有许多能被半乳糖苷酶降解半乳糖苷类物质，其分解产物不能深入代谢，积累，抑制细胞生长。半乳糖苷乙酰化后，即无毒,.,所以,lacA,虽不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物质积累,代谢调节与代谢工程,第19页,R,是指调整基因，调整分泌阻遏物或诱导物；,O,是指操纵基因，与乳糖结合部位；,P,是指开启子，开启基因转录和翻译。,代谢调节与代谢工程,第20页,操纵元,是一个完整含有特定功效细菌基因表示和调整单位，包含,调整基因,，,操纵位点,，,结构基因,，组成一个控制单元,结构基因：,产生,mRNA,合成蛋白质,操纵位点,promotor,operator,：开启子结合位点,调整基因：产生调整蛋白,（与操纵位点结合）,结构基因不转录,诱导物存在时，可与阻遏蛋白结合,结构基因转录,Control element,Structural genes,代谢调节与代谢工程,第21页,酶诱导现象,B-,半乳糖苷酶,代谢调节与代谢工程,第22页,分解底物酶只有在底物存在时才出现！,无乳糖时，几个,B-gal/cell,加入乳糖时，,5000,个,再去掉乳糖，,lac mRNA,下降,乳糖能激发,lac mRNA,合成,乳糖诱导作用是由酶前体转化而来，还是诱导新酶合成？,培养基（,35,S-aa,无乳糖）,E.coli,繁殖,培养基（无,35,S-aa,加入乳糖）,-gal(,无,35,S),代谢调节与代谢工程,第23页,调控机理,1,调控区结构,lacI,1045bp,，独立,Pi,P,82bp,，,82,1,O,35bp,，,7,28,lacZYA,代谢调节与代谢工程,第24页,体外结合竞争试验,:,阻遏物,RNA pol,off,RNA pol,阻遏物，,on,2.,阻遏状态,代谢调节与代谢工程,第25页,4,诱导物不是乳糖,生成,lac,诱导物,乳糖代谢,Allolctose,异构乳糖,别乳糖,细胞内,-,半乳糖苷酶起源,?,代谢调节与代谢工程,第26页,gratuitous inducer,抚慰诱导物 义务诱导物,可诱导半乳糖苷酶产生，但不是其底物,IPTG,，异丙基半乳糖苷,TMG,，巯甲基半乳糖苷,ONPG,O-,硝基半乳糖苷,在研究诱导作用时，极少使用乳糖,代谢调节与代谢工程,第27页,阻遏蛋白作用机制,1,阻遏蛋白结构,38KD,，,4,聚体,，,一个亚基结合一个,IPTG,分子,lacI,组成型转录,Pi,弱开启子，,5,10,个,cell,含有二重性,阻止转录（与,lacO,结合）,开始转录（与,诱导物,结合）,代谢调节与代谢工程,第28页,阻遏蛋白结构域,头段,，,-NH2,端，,lacO,结合区,绞链区,关键段,，,-COOH,，,诱导物结合区,代谢调节与代谢工程,第29页,4,个亚基关键片段接触形成四聚体,代谢调节与代谢工程,第30页,代谢调节与代谢工程,第31页,对称轴，,+11,对称序列，,6bp,阻遏蛋白结合位点,lacO,结构,代谢调节与代谢工程,第32页,3,阻遏蛋白对,RNA pol,功效影响,阻遏蛋白和,RNA pol,可同时与,DNA,结合,RNA pol,与开启子结合平衡常数,1.9X10,7,有阻遏蛋白时,2.5X10,9,结合着,RNA pol,不能转录,.,但加入诱导物后,释放出阻遏蛋白,变为开放型开启子复合物,.,阻遏蛋白实际上使,RNA pol,贮存在开启子上。,这一模式是否存在于其它操纵元系统中？,代谢调节与代谢工程,第33页,葡萄糖对,lac,操纵元表示抑制是间接,葡萄糖降解是经过,cAMP,与,CAP,结合起作用,cAMP:,环化腺苷酸,CAP,catabolite activator protein,由,crp,编码,CRP,catabolite receptor protein,代谢调节与代谢工程,第34页,代谢调节与代谢工程,第35页,因为序列差异，使不一样基因受,cAMP,激活水平不一样,结合位点序列保守,代谢调节与代谢工程,第36页,3 CAP,结合对,DNA,构型影响,DNA,弯曲,弯曲点位于,CAP,结合位点二重对称中心,弯曲使,CAP,能与开启子上,RNA pol,接触,代谢调节与代谢工程,第37页,（,1,）,CAP,结合位点与转录起始点位置,CAP,与,转录起始点,距离，相距数个整双螺旋,CAP,结合位点在,开启子,上下游，都能发挥作用,4,CAP,对转录影响,代谢调节与代谢工程,第38页,（,2,）基因转录对,cAMPCAP,系统依赖性，与开启子本身效率相关,cAMP-CAP,复合物结合，使位点,II,附近富含,GC,区域双螺旋结构稳定性降低，因而,-10,区熔解温度降低，促进开放型开启子复合物形成,代谢调节与代谢工程,第39页,（,3,）,CAP,激活转录方式,CAP,直接作用于,RNA pol a,亚基,缺失,RNA pol a,亚基,C,末端时，失去受,CAP,激活能力,作用于,DNA,，改变其结构,代谢调节与代谢工程,第40页,7.1.6 lac operon,其它问题,lac operon,功效是在,正负,两个调控体系协调作用,(coordinate regulation),下实现。,阻遏蛋白封闭转录时，,CAP,不发挥作用；如没有,CAP,加强转录，即使阻遏蛋白从,P,上解聚仍无转录活性,CAP,组成型合成，所以,cAMP,CAP,复合物取决于,cAMP,含量,腺苷酸环化酶位于细胞膜上，其活性与葡萄糖运输酶相关，所以,cAMP,CAP,调控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等糖类代谢相关酶,降解物敏感型操纵元：只要有葡萄糖存在，这些操纵元就不表示,代谢调节与代谢工程,第41页,Summary,代谢调节与代谢工程,第42页,代谢调节与代谢工程,第43页,Summary of lac operon regulation,Glucose,cAMP,Lactose,Transcription of lac mRNA,High,Low,Present,low rate of expression,High,Low,Absent,essentially none,Low,High,Absent,essentially none,Low,High,Present,high rate of expression,代谢调节与代谢工程,第44页,若是因为某种原因，,调整基因,或者,操纵基因发生突变后,，阻遏物失去同操纵基因结合能力或者使突变后操纵基因失去对阻遏物亲和力。此时即使,没有诱导物，,RNA,聚合酶也能转录。,这种突变称为,组成性突变,。,代谢调节与代谢工程,第45页,组成型突变株取得,在诱导物（低浓度）为限制性基质恒化器中筛选,将菌株轮番在有、无诱导物培养基中培养,使用诱导性很差基质,使用阻遏诱导作用抑制剂,提升筛选效率,代谢调节与代谢工程,第46页,2,、分解代谢物阻遏,定义：,由底物分解过程中产生代谢物引发，这种阻遏现象称为分解代谢产物阻遏。,现象：,若微生物培养基中存在一个以上可利用养分，通常它们会先分解那些最易利用基质，只有该基质耗竭后才开始分解第二种基质。,代谢调节与代谢工程,第47页,代谢调节与代谢工程,第48页,分解代谢物分子机制,Camp-CRP,复合物在开启基因上结合是,RNA,聚合酶结合到开启基因上所必须。,代谢调节与代谢工程,第49页,分解代谢物阻遏作用克服,不使用阻遏性碳源。,出于经济问题，必须使用阻遏性碳源，则可用过程补糖方法。,使用不能代谢诱导物类似物、或者迟缓补入诱导物、或者只能使用迟缓代谢诱导物衍生物。,代谢调节与代谢工程,第50页,3,、反馈调整,反馈调整普通分为,反馈抑制,和,反馈阻遏,两种形式：,反馈抑制作用,是末端代谢产物抑制其合成路径中参加前几步反应酶（往往是催化第一步反应酶）。,反馈阻遏作用,是末端代谢产物阻止整个代谢路径酶合成作用。,代谢调节与代谢工程,第51页,代谢调节与代谢工程,第52页,Trp operon,生物细胞中氨基酸合成，也受操纵元调整。细胞需要某种氨基酸时，其基因即表示，不需要时基因关闭，到达经济标准。,代谢调节与代谢工程,第53页,trpR,阻遏蛋白,P,，,-40+18,O,-21+1,L,+1+162,结构基因,t,A,下游,36bp,不依赖,p,t,t,下游,250bp,，依赖,p,基因组成,代谢调节与代谢工程,第54页,sne298,代谢调节与代谢工程,第55页,Trp operon,阻遏系统,1 Trp R,四聚体,代谢调节与代谢工程,第56页,阻遏蛋白,trp,有活性阻遏物,SNE299,trp O,不转录,代谢调节与代谢工程,第57页,2,阻遏蛋白结合位点,trpO -21 +1,，反向重复序列,trpP -40 +18,活性阻遏物与,trpO,结合与,RNA pol,与开启子结合发生竞争,SNE299,代谢调节与代谢工程,第58页,3,阻遏系统,主管转录是否开启，,在缺乏,Trp,时，,mRNA,起始合成，但不能自动延伸，普通在,trpE,之前终止转录,粗调开关,代谢调节与代谢工程,第59页,弱化作用,attenuation,1,弱化子，衰减子，,前导,RNA,，,140bp,代谢调节与代谢工程,第60页,弱化子，,衰减子，,代谢调节与代谢工程,第61页,序列分析发觉，其中,4,个片段进行配对，形成不一样二级结构,Terminator,代谢调节与代谢工程,第62页,S312,P,O,E,4,3,2,1,L,DNA,RNA,ATG,TGA,2 trp codons,1,4,3,2,2,前导肽,14aa,代谢调节与代谢工程,第63页,代谢调节与代谢工程,第64页,3,转录弱化作用,Lack of trp,Lack of aminoacyl tRNA,Ribosome pause at trp codons,occluding sequence 1,Form 2:3 hairpin,anti-terminator,Transcription into trpE and beyond,代谢调节与代谢工程,第65页,High trp,Trp is inserted at the trp codons,Translate to the end of leader message,Ribosome occlude sequence 2,Terminate transcription at(3:4 form,terminator,),代谢调节与代谢工程,第66页,弱化子对转录调控关键,空间结构，,10th and 11th codons encode trp residues (rare AA),时间，核糖体停顿在,2,个,Trp,密码子上时，产生延宕，此时,4,区未转录出来,The leader peptide is to determiner trp availability and to regulate transcription termination,14amino-acid(encoded by 27-68 of the leader RNA,summary,代谢调节与代谢工程,第67页,阻遏作用与弱化作用协调,阻遏效率,开启子转录起始频率在,R+,和,R-,相差,70,倍,弱化作用,trp,存在时，约有,10,RNA pol,侥幸转录,-trp,活性阻遏物 ,无活性阻遏物,+trp,trp,操纵子含有双重调整体系？,代谢调节与代谢工程,第68页,Negativerepressible operon,能够被最终合成产物所阻遏,R,P,O,leading seq.E D C B A,trp,+,为何需要阻遏体系？,当大量,Trp,存在时，阻遏系统起作用。阻遏物与之结合，阻止先导,mRNA,合成。,经济,代谢调节与代谢工程,第69页,仅有少许,trp,时，,RNApol,开启，,但在,L.S.,处脱落，转录中止,R,P,O,leading seq.E D C B A,少许,trp,+,不足以结合,O,位点,为何需要弱化系统？,当,trp,浓度低时，阻遏物从有活性变为无活性，速度极慢，不能很快引发,trp,合成。所以需要一个能快速作出反应系统，以保持培养基中适当,Trp,水平。,代谢调节与代谢工程,第70页,细菌演化出弱化系统生物学意义,经过,tRNA,荷载是否进行调控，更为灵敏,氨基酸主要用途是合成蛋白质，因而,tRNA,荷载为标准进行调控更为恰当,两个调控系统，防止浪费提升效率,阻遏系统 高水平,trp,时，不转录,低水平,trp,时，转录至,LS,弱化系统 细调,原核生物细致精细调控机制,增强原核生物对环境适应性,代谢调节与代谢工程,第71页,代谢调节与代谢工程,第72页,避开末端代谢产物反馈调整作用方法：,1,）从遗传上改造微生物，,使之对末端产物反馈调整作用不敏感。,2,）改变培养环境条件，,以限制末端代谢产物在细胞内部积累。,反馈调整作用消除：,生产实践中，为了取得某一合成路径中间产物，常见限制末端产物在胞内积累方法。,代谢调节与代谢工程,第73页,分支路径调整方式,-,末端产物调整,（,1,）同功酶：,同功酶是几个在一个细胞中催化同一反应酶。他们通常催化分支路径中头一个酶，分别受不一样末端产物反馈抑制。,同功酶反馈抑制,代谢调节与代谢工程,第74页,（,2,）协同反馈抑制：,只有一个酶受反馈调整控制，要抑制或者阻遏这种酶需要分支代谢路径中全部末端产物都过量存在，单个末端产物积累对该酶催化活性几乎没有影响。,代谢调节与代谢工程,第75页,（,3,）累积反馈抑制：,分支路径每一个末端产物积累只能个别抑制或者阻遏路径中第一个酶，只有在全部末端产物都过量存在时，才会完全抑制或者阻遏该酶。,代谢调节与代谢工程,第76页,代谢调节与代谢工程,第77页,（,4,）次序反馈抑制,：,分支代谢路径中末端产物，不能直接抑制代谢路径中第一个酶，而是分别抑制分支点后反应步骤，造成份支点上中间产物积累，这种高浓度中间产物再反馈抑制第一个酶活性。,代谢调节与代谢工程,第78页,（,5,）联合激活或者抑制作用：,这是由一个反应系列形成中间产物参加,2,个完全独立路径调整。,代谢调节与代谢工程,第79页,微生物代谢调整多样性,代谢调节与代谢工程,第80页,作 业,微生物代谢特点是什么？,酶活性调整实质与主要方法是什么？,酶合成调整方式包含哪些？,反馈调整包含哪些形式，怎样消除反馈调整作用？,代谢调节与代谢工程,第81页,酶活性调整分子机制,1,、别构调整理论（关键是酶分子构象改变）。,2,、酶分子化学修饰理论（关键是酶分子结构改变）。,酶合成调整分子机制,基因转录改变。,3.3,代谢调整分子机制,代谢调节与代谢工程,第82页,1,、微生物细胞代谢调整内容,*,调整代谢流,*,调整营养物质透过细胞膜而进入细胞能力,*,利用微生物代谢调控能力自然缺损或经过人为方法,取得突破代谢调控变异菌株，可为发酵工业提供生产,相关代谢产物高产菌株。,3.4,代谢调整,代谢调节与代谢工程,第83页,细胞膜透性调整,细胞膜透性正常，代谢物累积，反馈抑制或阻遏,细胞膜透性改变，代谢产物不停透出细胞外，可预防反馈抑制或阻遏,调整细胞膜渗透性方法,生理学方法,遗传学方法,2,、代谢调整方式,代谢调节与代谢工程,第84页,1.,亚适量生物素调整：谷氨酸发酵,Effect of Biotin level on the production of Glutamate,生理学方法,代谢调节与代谢工程,第85页,亚适量生物素调整机制,:,控制生物素改变膜成份,进而改变膜透性、谷氨酸分泌和反馈调整,代谢调节与代谢工程,第86页,2.,适量青霉素,机理,:,抑制细菌细胞壁肽聚糖合成中转肽酶活性，肽聚糖结构中肽桥无法交联，造成细胞壁缺损，利于代谢产物渗出。,注意：低生物素、青霉素只对生长态（分裂）细胞有效，对稳定时细胞无作用,。,代谢调节与代谢工程,第87页,油酸：含有一个双键,C,18,不饱和脂肪酸，是细胞膜磷脂中主要脂肪酸。油酸缺点型因不能合成油酸而使细胞膜缺损，细胞膜通透性加大。,遗传学方法,细胞膜缺损突变,代谢调节与代谢工程,第88页,直线式合成路径中，营养缺点型菌株只能积累中间代谢产物，不能积累最终代谢产物。,分支代谢路径中，经过解除某种反馈调整，可使某一分支路径末端产物得到积累。,赖氨酸发酵,营养缺点型突变株或突变株调整代谢,代谢调节与代谢工程,第89页,AK,天冬氨酸激酶；,HSDH,高丝氨酸脱氢酶,代谢调节与代谢工程,第90页,天冬氨酸,人工控制谷氨酸棒杆菌代谢过程生产赖氨酸,中间产物,天冬氨酸激酶,中间产物,甲硫氨酸,苏氨酸,高丝氨酸,高丝氨酸,脱氢酶,不能合成,能够大量积累,赖 氨 酸,人工诱变,菌种不能产生,代谢调节与代谢工程,第91页,3.4,代谢工程,代谢工程又称,路径工程,定义：普通认为是经过,特定生化反应,修饰来定向改进细胞特征或者,利用重组,DNA,技术,来改造新化合物。,代谢调节与代谢工程,第92页,代谢调节与代谢工程,第93页,研究内容,在微生物体内建立新代谢路径以取得新代谢物,(,链霉菌聚乙酮）；,生成异源蛋白（如人体胰岛素、人血清白蛋白）；,改进已存在路径（如抗生素，工业酶等）。,代谢调节与代谢工程,第94页,研究方法,生理状态；,代谢（物）流分析；,代谢流控制分析；,代谢路径热力学分析；,动力学模型。,代谢调节与代谢工程,第95页,改进微生物合成产物得率与产率。,扩充可利用基质范围,合成对细胞而言是新产物或全新产物,改进细胞普通性能，如耐氧或抑制性物质能力,降低抑制性副产物形成,环境工程方面,药品合成方面，作为中间体手性化合物制备,在医疗方面用于整体器官和组织代谢分析,信息传导方面,代谢工程应用：,代谢调节与代谢工程,第96页,代谢调节与代谢工程,第97页,