DB35∕T 1958-2021 鸭巴泰病毒 RT-PCR 检测方法(福建省).pdf

ICS 11.220 CCS B 41 35 福建省地方标准 DB35/T 19582021 鸭巴泰病毒 RT-PCR 检测方法 Detection method of RT-PCR for duck Batai virus 2021 - 02 - 09 发布 2021 - 05 - 09 实施福建省市场监督管理局 发 布DB35/T 19582021 I目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 设备、材料和试剂 . 1 5 样品采集、前处理和保存 . 2 6 RT-PCR 操作步骤 . 2 7 结果判定 . 3 附 录 A （规范性）试剂的配制及引物参考序列 . 4 附 录 B （资料性）RT-PCR 检测结果电泳图 . 6 DB35/T 19582021 II前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 本文件由福建省农业科学院提出 本文件由福建省农业农村厅归口。 本文件起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福州海关技术中心、福建省动物疫病预防控制中心、宁德海关检验检疫技术中心。 本文件主要起草人：傅秋玲、傅光华、郑腾、李中华、叶洪、黄瑜、万春和、程龙飞、施少华、张体银、刘荣昌、陈翠腾、彭春香、陈红梅、陈珍、朱春华。DB35/T 19582021 1鸭巴泰病毒 RT-PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了鸭巴泰病毒核酸诊断的反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）的检测方法。 本文件适用于鸭巴泰病毒感染的流行病学监测和诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 66822008 分析实验室用水规格和试验方法。 GB 194892008 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鸭巴泰病毒 Batai virus；BATV 该病毒属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）正布尼亚病毒属（Orthobunyavirus）的成员，为有囊膜病毒，其基因组为单股负链分节段RNA，大小约12 kb，包含S、M和L等3个基因片段，分别编码病毒的核衣壳蛋白，囊膜蛋白和聚合酶蛋白。 3.2 鸭巴泰病毒病 Batai virus disease 鸭巴泰病毒病在我国养禽业中，尤其是种番鸭、麻鸭中流行，其临床表现以种（蛋）鸭产蛋下降、卵巢出血和脾脏轻度出血为特征，与禽坦布苏病毒病相似，易引起临床混淆甚至误诊。此外，该病还危害肉鸭，临床上以生长不良为特征。 4 设备、材料和试剂 4.1 设备 4.1.1 PCR 扩增仪。 4.1.2 微量可调移液器（100 L1000 L、20 L200 L、2 L20 L、0.5 L10 L） 。 4.1.3 冰箱（2 8 、-20 ） 。 4.1.4 高速冷冻离心机（其最高转速应大于 12 000 r/min） 。 4.1.5 组织匀浆器。 4.1.6 手术剪。 4.1.7 手术镊。 DB35/T 19582021 2 4.1.8 电泳仪。 4.1.9 电泳槽。 4.1.10 凝胶成像系统。 4.1.11 旋涡振荡器。 4.1.12 超净工作台。 4.2 材料和试剂 4.2.1 试验用水应符合 GB/T 66822008 中一级水的规格要求。 4.2.2 磷酸盐缓冲液（PBS）配制方法见附录 A 的 A.1。 4.2.3 焦炭酸二乙酯处理水（Diethy Pyrocarbonate，DEPC 水）配制方法见附录 A 的 A.2。 4.2.4 Trizol。 4.2.5 三氯甲烷。 4.2.6 异丙醇。 4.2.7 无水乙醇。 4.2.8 75%乙醇：配制方法见附录 A 的 A.3。 4.2.9 溴化乙锭溶液：配制方法见附录 A 的 A.4。 4.2.10 1TAE 缓冲液：配制方法见附录 A 的 A.5。 4.2.11 1.0%琼脂糖凝胶：配制方法见附录 A 的 A.6。 4.2.12 DNA 相对分子质量标准物：DL2 000。 4.2.13 10加样缓冲液：配制方法见附录 A 的 A.7。 4.2.14 RT-PCR 检测用引物和使用方法见附录 A 的 A.8。 4.2.15 对照样品：以提取的鸭巴泰病毒提取的核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA）作为阳性对照，以其他禽源 RNA 病毒（如禽坦布苏病毒）RNA 样品作为阴性对照，以灭菌去离子水作为空白对照。 5 样品采集、前处理和保存 5.1 样品采集和运输 采样所用器具 （手术剪、 手术镊和容器等） 应预先灭菌处理， 在采样过程中应戴一次性手套和口罩，以免样品间交叉污染。采集产蛋下降疑似病鸭的卵巢或（和）脾脏装入灭菌过的容器中，编号后置于冷藏箱内在24 h内送至实验室。 5.2 样品处理 在超净工作台中取出采集的待检样品置于灭菌平皿内，充分剪碎后与磷酸盐缓冲液按体积比1:3的比例制成组织匀浆液，反复冻融3次后于4 10 条件下8 000 r/min离心30 min，取上清用于核酸（RNA）的抽提，或置-20 条件下冻存备用。 5.3 样品保存 采集或处理的样品，在2 8 条件下保存应不超过24 h。否则，需保存在-20 条件下，但时间不超过7 d；若需较长时间待处理，应保存在-70 条件下，且应避免反复冻融。 6 RT-PCR 操作步骤 DB35/T 19582021 36.1 病毒 RNA 提取 病毒RNA提取应采用以下步骤或等效的商品化RNA提取试剂盒进行，且在实验操作过程中应遵守GB 194892008的要求。 取200 L待检样品，加入1 mL Trizol试剂，用移液器充分混匀，室温放置5 min；加入200 L三氯甲烷，旋涡振荡30 s混匀，室温放置15 min；4 下12 000 r/min离心15 min；取上层水相加入等体积异丙醇，上下颠倒数次混匀，-20 放置20 min；4 下12 000 r/min离心15 min；弃上清液，沉淀用1 mL 75乙醇清洗；10 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀室温干燥5 min；加20 L DEPC水溶解RNA沉淀。-20 冰箱保存备用，RNA溶液应避免反复冻融，并尽快用于检测。空白对照、阴性对照和阳性对照进行同步操作。 6.2 RT-PCR 反应 RT-PCR反应体系为25 L，每个反应管的反应体系为：依次加入14 L 焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水，2.5 L反转录酶缓冲液，2.5 L Taq聚合酶缓冲液，0.5 L dNTP，0.5 L Taq聚合酶，0.5 L 反转录酶，0.5 L RNA酶抑制剂，上下游引物各0.5 L (10 mol/L)，样品的RNA各 3 L。混匀后2 000 r/min离心15 s，使反应混合液都沉降到PCR管底。将上述混合物按照以下步骤进行RT-PCR：第一步是反转录，42 ，30 min；第二步是PCR循环，94 预变性3 min；循环参数为94 变性30 s，52.4 退火30 s，72 延伸1 min，循环35 次；最后，72 延伸7 min。反应结束后，可将产物保存于4 。 6.3 RT-PCR 产物电泳 反应结束后，分别取待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品和空白对照样品各5 L RT-PCR产物与0.5 L加样缓冲液混合均匀，加入到1.0%琼脂糖凝胶板的样孔中；同时，在另一样孔中加5 L DL2 000标准分子量对照；以5 V/cm的电压电泳30 min后，经凝胶成像系统观察结果。 7 结果判定 7.1 结果判定标准 当阳性对照出现480 bp特异性条带（见附录B电泳图2号泳道）、阴性对照（见附录B电泳图3号泳道）和空白对照均无扩增条带（见附录B电泳图4号泳道）时，表明本次实验成立。 7.2 结果判定 当待检样品出现480 bp特异性条带（见附录B电泳图5号泳道），结果判为阳性，若无特异性扩增条带（见附录B电泳图6号泳道），结果判为阴性。 DB35/T 19582021 4 附 录 A （规范性） 试剂的配制及引物参考序列 A.1 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS） NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.15 g KH2PO4 0.2 g 将上述试剂溶于800 mL灭菌双蒸水中，定容至1 000 mL，1.034105 Pa高压灭菌30 min，4 保存备用。 A.2 焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水 于三蒸水按0.1%加入DEPC，磁力搅拌过夜，1.034105 Pa高压灭菌20 min，冷却备用。 A.3 75%乙醇 取无水乙醇750 mL加入灭菌双蒸水250 mL，定容至1 000 mL，-20保存备用。 A.4 溴化乙锭（EB）溶液 溴化乙锭 20 mg 灭菌双蒸水 至20 mL 说明：也可采用市售商品化的更环保、更安全的荧光染料，比如Goldviewer等。 A.5 1TAE电泳缓冲液 A.5.1 配制0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0） 二水乙二铵四乙酸二钠 18.61 g 氢氧化钠（10%） 调pH至8.0 灭菌双蒸水 至100 mL A.5.2 配制50TAE电泳缓冲液 三羟基甲基氨基甲烷（Tris） 242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0） 100 mL 灭菌双蒸水 至1 000 mL 用时用灭菌双蒸水稀释50倍使用。 A.5.3 配制1TAE电泳缓冲液 50TAE电泳缓冲液 20 mL 灭菌双蒸水 至1 000 mL A.6 1.0%琼脂糖凝胶 琼脂糖 1.0 g DB35/T 19582021 51TAE电泳缓冲液 至100 mL 置微波炉中加热至完全融化， 待冷至50 60 时， 加荧光染料溶液5 L， 摇匀后倒入制胶板中，待完全凝固后取下加样梳，备用。 A.7 10加样缓冲液 聚蔗糖 25 g 溴酚蓝 0.1 g 二甲苯青 0.1 g 灭菌双蒸水 至100 mL A.8 RT-PCR检测用引物序列为 BATV-F 5-CTGCAGTTTTMAGATTGTTTC-3 BATV-R 5-TGTTTTATTTCCTGTAGGTAC-3 注1：M（A/C）。 注2：此对引物针对BATV囊膜蛋白M基因设计而成，扩增片段约480 bp，用无菌双蒸水溶解至10 mol/L后，保存于-20 备用。 DB35/T 19582021 6 附 录 B （资料性） RT-PCR 检测结果电泳图 RT-PCR检测结果电泳图如图B.1所示。 说明： 1DNA 分子量 Marker； 2BATV 阳性对照扩增结果； 3BATV 阴性样品扩增结果； 4空白对照扩增结果； 5待检 BATV 阳性样品扩增结果； 6待检 BATV 阴性样品扩增结果。 图 B.1 RT-PCR 检测结果电泳图