流式细胞术实验技巧及数据分析.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,流式细胞术实验技巧及数据分析,上海交通大学医学院,史桂英,1,BD公司不同型号流式细胞仪,FACSCalibur,LSRII,FACSAria,FACSCount,FACSVantage&DiVa,FACSCanto,2,一 流式细胞仪的基本原理,*稳定流动,*激发光斑,*荧光补偿,*荧光素选择,二 数据分析及开窗,3,FCM原理示意图,4,层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流 的形成要满足雷诺数,dV,Re,=,2300，,式中、分别为液体的密度和粘滞系数，d和V分别为管道的直径和液体的平均流速。FCM利用层流技术,使细胞流动稳定,并具有自聚焦作用,为细胞分析分选提供技术保证.,层流技术,5,液流驱动系统,（示意图）,流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2),V,2,(忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。,6,7,低速 高速不同样本速率形成的样本流,8,激发光源与光束成形系统,9,.,20um,64um,32um 0 32um,聚焦距离,激光束,聚焦透镜,强度,光束成形与细胞受照方式,这种椭圆形光斑的检测区保证每个细胞分别受到光照且受检时受到一致的光照,FCM的单细胞照明技术,10,11,荧光光谱重叠,FITC和PE荧光光谱重叠,12,Uncompensated vs Compensated,FL1,FL2,利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的方法称“,荧光补偿,”,荧光补偿,13,荧光补偿,14,Mean值判断补偿,15,双或多参数荧光抗体的组合标记,FITC+PE 488 525、575 绿色、橙色,FITC+T red 488 525 绿色,568 615,红色,FITC+PeCy5 488 525、675,绿色、红色,FITC+ECD 488 525、625 绿色、橙红色,F+P+PeCy5 488 525、575、675 绿、橙、,红色,F+ECD+PeCy5 488 525、575、675,绿、橙红色、,红色,F+P+PeCy5+APC 488 525、575 绿色、橙色,633 670,红色,荧光染料 激发波长（nm)发射波长（nm)颜色,16,用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一,起，在488nm,波长激发光激发后产生的发射波长,激发另一荧光染料产生的荧光信号。,Laser,CY7,755,PE,ECD,620,CY5,670,488nm,能量传递染料：,17,流式细胞术操作流程：,培养细胞,新鲜组织,石蜡包埋,单细胞悬液,制备,荧光抗体标记,上机检测,表型测定,细胞分选,继续培养,FISH,PCR,统计学分析,18,单分散细胞,19,FSC,FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关,20,SSC,SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关,21,细胞散色光信号,22,细胞荧光测量,细胞的自发荧光,未经染色的样品细胞,在激发光的照射下可测到有微弱的荧,光信号.,细胞的特异性荧光,经过各种特异染色的,细胞在,激发光的照射下可测到较强的荧光,信号.,23,自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图,自发荧光信号,24,特异染色的荧光信号,25,DNA分析比较,26,排除双联体细胞,27,细胞阻滞在G,2,M期,28,双克隆细胞周期分析,29,溴脱氧尿嘧啶核苷,(Bromodeoxyuridine，,BrdUrd),是胸苷的一种类似物。,它可以替代,胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S,期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd,单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅,可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同,时可以了解不同细胞的DNA合成能力高低,。,BrdUrd和DNA双标记染色,30,31,BrdUrd与PI检测,32,BrdUrd与PI检测,33,BrdUrd与PI检测,34,细胞三色荧光检测,35,细胞因子测定,*检测T细胞(CD69)活化,36,G6=R1*R5,37,*,CD4抗原分子结构引起CD4荧光强度下调,38,细胞因子分析图,*过敏性鼻息肉与鼻息肉细胞因子比较,39,纯化单核细胞,40,调节性T细胞检测,41,42,G3=R1*R3,G4=R1*R4,43,凋亡细胞测定,44,凋亡细胞测定,45,细胞凋亡检测,46,阴性的设置,47,血小板检测,48,血小板检测,49,血小板检测,50,血小板检测,51,谢谢,52,