动物克隆研究进展及其展望-PPT.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,动物克隆研究现状及其展望,1,一、国内外研究现状,2,（一）概述,动物胚胎工程是当今生物工程的研究热点之一，目前主要向两头延伸：,胚胎工程,推广应用 高深研究,（胚移产业化）（克隆、转基因）,3,分子克隆：人工扩增生物大分子 克隆（Clone）细胞克隆：细胞系 （无性繁殖）胚胎细胞克隆 个体克隆（卵核移植）体细胞克隆,4,克隆源于希腊文，原意为树木的枝条，在生物学中系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称为无性繁殖系。,细胞核移植技术：将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖就可被激活、分裂并发育成新的个体、使得核供体的基因得到完全复制。,5,（二）哺乳动物胚细胞核移植,6,胚胎细胞克隆重大进展,技术基本成熟：如,1,枚牛胚获得了,7,头活牛犊。,继代克隆：牛连续克隆至第,7,代，获得了第,3,代犊牛，,1,枚胚连续克隆获得了,190,枚胚胎；山羊继代克隆,5,代共获得了,45,只不同代的后代，,1,枚胚连续克隆获得了,298,枚胚胎。,（类）胚胎干细胞系的建立：仅在小鼠上建立了 ES系（Evans Martin,1981），意义很大，可用ES细胞进行核移植。1995年，英国学者Campbell等，利用9.5天绵羊胚胎滋养层细胞培养传3代后作为核供体获得了后代，曾被评为96年世界十大科技新闻之一。1999年，小鼠ES细胞克隆获得成功（Wakayama et al.,1999），用长期培养的牛PGCs克隆后获得了一头公牛（Mueller et al.,1999）。,7,（三）体细胞克隆进展,成年体细胞：,绵羊,Dolly,，乳腺上皮细胞，,Wilmut et al.(1997),；,小鼠,30,余只，卵丘细胞，,Wakayama et al.(1998),；,牛,，,卵丘细胞,（,5,），,输卵管上皮,（,3,），,Kato et al.(1998),；老牛,颗粒细胞,（,2,），传代冻解，,Wells et al.(1998),；,乳腺上皮原代细胞,（,1,）与,耳皮肤成纤维细胞,（,1,），,Zakhart-chenko et al.(1999),；,肌肉细胞,（,4,），传,4,代，,Shiga et al.(1999),；,耳皮肤成纤维细胞,培养,3,个月传,15,代，,Kubota et al.(2000),；,山羊,，张涌等（,2000,）；成勇等（,2000,）；,Keefer et al.(2000),。,猪,，颗粒细胞核移植胚二次核移植，,Polejaevea et al.(2000),。,8,大家有疑问的，可以询问和交流,可以互相讨论下，但要小声点,9,胎儿成纤维细胞：,绵羊，,3,只，,Wilmut et al.(1997,）；,6,只，,Schnieke et al.(1997,）；,牛，,Cibelli et al.(1997);,；,Butler(1998),；,Zakhartchenko et al.(1999),；,Vignon et al.(1999),；,山羊，,Baguisi et al.(1999),；,猪，,Onishi et al.(2000),。,10,（四）哺乳类异种动物克隆研究进展,指核供体细胞与核受体细胞来源于两个不同的种系。,研究报导不多。,尚未见有异种克隆个体产生的报导，但有一些获得异种克隆囊胚甚至胎儿的报导。,大熊猫成年体细胞与去核兔卵母细胞重建得到了异种体细胞克隆囊胚（陈大元等，,1999,）。,11,二、动物克隆的技术路线,12,（一）供体核的分离技术,1.,胚细胞 用,0.2%,链霉蛋白酶预处理胚胎,然后机械法剥离透明带,钝头玻璃吸管反复吹吸以分离成单个卵裂球。,2.,体细胞 最早是用青蛙肠粘膜上皮细胞的核获得后代。,Wilmut,等将绵羊乳腺细胞在特定的实验条件下增殖培养,6,天，诱使细胞处于静止状态，以便染色质结构调整和核进行重组，从而获得了克隆绵羊“多莉”，开创了哺乳动物体细胞核移植（克隆）的新纪元。,13,（二）受体细胞的去核技术,现一般均采用超数排卵回收的卵母细胞或体外培养成熟的卵母细胞，并将其置 于含细胞松弛素,B,和秋水仙胺的培养液中，一端用固定吸管固定，另一端用一尖头吸管（,30m,）穿透透明带进入卵周隙，或用一细长玻璃针刺破并切开一部分透明带，再用呈直角的去核吸管经切囗抵住细胞膜，操纵去核吸管，从第,1,极体外吸除第一极体及时性于分裂中期的染色体和周围的部分细胞质。,14,（三）,核卵重组技术,在显微操作仪操纵下，用去核吸管吸取一枚分离出的完整卵裂球，注入去除核的受体卵母细胞的卵周隙中。,15,（四）,重组胚的融合技术,由于微吸管破坏了卵膜及一部分细胞质，若直接移植则成功很低，故需对重组胚进行融合，现多采用电融合法,将重组胚置于融合小室内，使核一质集结面与电极相平行，在一定的电场强度下，给予一定时间的矩型直流电脉冲促使其融合。,16,（五）,核移植胚的培养与移植或重复克隆技术,融合后的胚胎在体外培养或经过中间受体培养至桑椹胚或囊胚，然后移入与胚龄同期的受体动物子宫角内，可望获得克隆后代。获得的早期胚也可作为供体核重新克隆。,17,三、意义及发展前景,18,（一）意义,为动物胚胎发生、死亡及其调控以及人的生长、衰老等研究提供研究手段。,为许多研究如肝癌等提供大量遗传性状一致的动物模型。,提供人体代用器官或生产大量生物药品。,优秀种畜的快速纯繁扩群，加快新品种选育的进程。,拯救珍贵濒危动物。,19,（二）发展前景,进展快、意义大，但还有许多问题有待解决，仍是当今生物界研究的热点。,2000,年武汉动物繁殖研讨会上，众多专家认为，十五期间，在胚胎移植产业化的同时，克隆、转基因、胚胎干细胞等研究将会有更大的进展，建议并相信国家会有更大强度的资助。,20,四、我们实验室拟开展的 研究工作,21,南京农业大学,动物胚胎工程技术中心,去年底借搬迁实验室之际，我们对原有的胚胎室进行了扩充，面积达到了,100M,2,，并为克隆预留了无菌室。利用学校贷款新添置了,CO,2,培养箱、生物显微镜、电子天秤等仪器。最近校长投资,50,万元用于购置显微操作系统等。,最近学校正式成立校级动物胚胎工程技术中心，并在为下一步申请成立省级动物胚胎工程技术作准备。,目前本中心直接从事胚胎工程研究的人员有,4,名教师与近,10,名研究生。,22,（一）胚胎干细胞系的建立,胚胎干细胞具有,全能性,与,无性繁殖,两大特点，为克隆动物无限量地提供种质资源。早在,80,年代初世界上就已建立了,小鼠,ES,细胞系,，但其它一些动物只是建立了类,ES,细胞系。这次全国动物繁殖研讨会上，专家一致认为，攻克并建立,ES,细胞系已迫在眉睫。我们实验室已有多年从事胚胎与细胞培养的经验，以此为出发点，近期先建立类,ES,细胞系是完全可能的。,23,（二）体细胞克隆的研究,克隆的目的在于大量繁殖经济价值高的良种或稀有动物。我们选择以名犬或种羊为对象，其数量少、价值高，不仅科学上有突破意义，而且为将来开发应用奠定基础。南京警犬研究所是公安部直属的、集警犬科研与养殖的大型研究所，可以为该项研究提供宝贵的种质资源。种羊可选用波尔山羊或绵羊无角道赛特等。目前先开始用兔作试验。,24,注核 移植,一 群 名 犬 或 种 羊,名犬或种羊克隆示意图,卵母细胞,去核,去核卵母细胞,皮肤组织,皮肤细胞,体外传代,25,26,五、关于克隆人的问题,27,现代生殖生物技术的飞速发展对畜牧业生产起到了很大的推动作用，产生了 大的经济效益。同时也不可避免地对人类传统的价值观念，伦理道德准则提出了挑战。克隆技术一旦用于人类，所复制的仅为躯体，而意识思维、情感和知识并不会在无性繁殖中得到延续，对社会无任何益处，相反带来的社会问题却是非常严重的，故应彻底杜绝克隆人的研究。,28,