动物心梗实验设计方案.doc

联系个人所学专业，选取某种或某类疾病，设计相关实验的动物模型,详细描述其方法及步骤，并阐述所选动物种类和级别的理由以及该动物日常生活和实验的环境要求(包括进出该环境的顺序），实验过程中的注意事项
MicroRNA—378(miR-378）在心肌肥厚中的研究
一、实验原理：
microRNA（miRNA)是一类小分子非编码单链RNA，长约22个碱基，能通过与靶mRNA3’非翻译区(3’UTR)互补配对，使其翻译受到抑制,从而在转录后水平对生物体内基因时序性表达起到精细调节作用。miRNA的表达变化与心肌肥厚的发生、发展密切相关。本实验通过异丙肾上腺素和去甲肾上腺素诱导实验动物心肌肥厚，然后用PCR技术测定心肌细胞中miRNA的变化.
二、实验目的：
通过统计学方法观察miRNA在正常心肌细胞和心肌肥厚的心肌细胞中的差异，从而将miRNA作为诊断心肌肥厚的潜在的生物学标志。
三、实验材料及步骤：Wistar雄性大鼠30只（200～250g/只，SPF级别）,异丙肾上腺素(ISO)，去甲肾上腺素(NE），生理盐水。
3。1 分组及造模
3。1。1采用随机数表的方法讲30只wistar大鼠随机分成三组,每组10只,分别为对照组、ISO处理组、NE组。
3。1.2ISO处理组：10只大鼠连续7天背部皮下注射ISO( 4 mg/kg/天），制成心肌肥厚模型。
NE处理组：10只大鼠连续7天背部皮下注射NE（ 4 mg/kg/天），制成心肌肥厚模型。
对照组：10只大鼠同法背部皮下注射生理盐水（4 mg/kg/天），制成心肌肥厚模型。
3.2检测造模是否成功
3.2。1高频超声检测
分别于造模后第2周,称取大鼠质量，10％水合氯醛麻醉大鼠后，仰卧固定，将其胸前部剃毛，应用TOSHIBA-6000超声诊断仪，频率为7.5 MHz的探头置于其胸左侧，取径(LVEDD，LVESD）。左室射血分数(EF，％)、左室短轴缩短率（FS，%）、计算左室左室长轴切面,图像深度调至3。0 cm，由二维超声引导,将M型超声取样线置于二尖瓣腱索水平，垂直于室间隔及左室后壁，经M型超声曲线进行测量,每一超声测定值取3个连续心动周期测量均值。超声测量指标：舒张末期及收缩末期室间隔厚度(IVSTd，IVSVTs）、舒张末期及收缩末期左室后壁厚度(LVPWTd，LVPWTs)、舒张末期及收缩末期左室内质量（LVM，mg）。
3。2。2大鼠心肌质量指数的测定
称取大鼠体质量（body weight， BW）,摘眼球取血备用，脱颈椎处死，快速打开胸腔取心脏，去除心房组织，分离左、右心室，生理盐水漂洗去血，用滤纸吸干表面水分，电子天平准确称取左心室质量(left ventricle weight, LVW）和全心质量（heart weight， HW）。计算左心室质量与体质量的比值（LVW/BW）、全心质量与体质量的比值（HW/BW)，分别记为左心室质量指数（left ventricular weight index , LVWI）和全心质量指数（heart weight index, HWI）。
3.2。3心肌细胞横断面面积测定
每组随机取3只大鼠,取左心室中段,10%福尔马林液固定的心肌组织经乙醇梯度脱水、透明、浸蜡包埋后,切成5 μm的切片,将左心室心肌进行HE染色，选择横断心肌的切片(细胞核清晰，细胞膜完整）放大400倍。用ImagePro Plus 4.0图像分析软件，测量左心室心肌细胞横断面面积.每一标本随机测量20个心肌细胞，计算其细胞平均横断面面积.
3.3测量miR-378水平
3.3.1 RNA提取：用RNA提取试剂盒提取各组大鼠先前在3.2。2中备用的血中的RNA,一切步骤按照试剂盒说明书。
3.3.2逆转录：将提取的RNA作为模板加入到20µlPCR体系中,在一定的反应条件下反应成 cDNA。
3。3。3miR—378水平的检测:将3。3。2中反应的 cDNA作为模板在20µlPCR体系中,在一定的反应条件下进行实时荧光定量PCR反应。
3.3.4用统计学方法比较观察处理组与对照组之间miR-378水平差异。
五、选择SPF级别Wistar雄性大鼠的理由：
现已遍及世界各国的实验室，价格便宜易得。
10周龄时雄性大鼠体重可达280~300g，性情温顺。
对传染病的抵抗力较强。
自发性肿瘤发生率低.
大鼠是研究心血管疾病的首选动物。
SPF动物( specific pathogen free animal)
即无特定病原体动物，指除清洁动物应排除的病原外,不携带重要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原。饲养在屏障系统中，是通过无菌动物、悉生动物而获得的。笼具、饲料饮水都要经过特殊处理，并有严格的检疫、消毒、隔离制度.所以科研实验主要使用SPF动物。
六、Wistar大鼠日常生活：
昼伏夜动 2、喜独居 3、胆小怕惊 4、喜啃咬 5、抗病力较强 6、敏感性强
七、SPF级动物实验室实验要求：
温度:18~29度，相对湿度：50%~80％ 12h昼12h夜。
1。从事SPF级实验大、小鼠的饲养管理工作的饲养员必须经过有关专业培训，持证上岗。
2.每次进入屏障环境前，须用塑料桶内配制消毒液，并消毒液擦拭桶壁后，紫外照射20分钟后待用。
3。饲养人员在进入屏障环境前，应在外更衣室脱去外衣,除下手表、手机、饰品等物品，换拖鞋，洗手(眼镜）。后进入内更衣室,穿戴净化衣、帽、口罩、手套，换拖鞋。拉开风淋室外门，人员进入后，立即关闭外门，风淋自动启动1分钟（已设置），进入清洁走廊。
4.饲养人员先从清洁储藏室把动物用的笼具、饲料、饮用水等物品经清洁走道分配至各区域的饲养室。
5。小鼠饲养笼具的更换周期至少2次/周,饲养人员应逐间更换饲养室的饲养笼、饮水瓶,添加饲料，每次更换下来的笼具、饮水瓶等物品通过污物走廊运至缓冲间,然后,擦拭笼架、地面、侧壁及门把等，检查饮水瓶有无漏水，喷雾消毒饲养室，再进入另一间饲养室同样操作.
6。饲养人员在工作中如发现有死亡动物时，应立即取出动物尸体,用塑料袋包装，记录笼号、动物死亡数、日期，并更换该鼠笼、笼盖、饲料及饮水瓶，把更换下来的物品及动物尸体一起送至污物走廊前端的缓冲间.
7。每月第一周周三更换各饲养室的排风口滤材,消毒擦拭顶壁、进风口及灯具罩。
8.每批动物实验结束后，应把该批动物的笼器具拿出屏障环境清洗，高压灭菌后再使用。
9。每次更换笼具工作结束后,饲养人员应检查各饲养室的门是否全部关闭，拖拭清洁走道、清洁储藏室、缓冲间、更衣室、次清洁走道的地面，然后走出屏障环境外。
10.在确认屏障环境内无人员后，开启紫外灯，照射20分钟。
八、进出该环境的顺序
人员：更衣－淋浴－更衣－清洁走廊－饲养室或动物实验室－污染走廊－洗刷消毒室——更衣-—外部区域。
物品：包装－高压消毒（已包装消毒的可经传递窗，清结笼具经有消毒液的渡槽)－清结准备室－清洁物品储存室－饲养室或动物实验室－（污物经包装处理）污染走廊－外部区域。
动物:动物(带专用包装）－传递窗－检疫室－清洁走廊－饲育室或实验室－(实验后或生产供应)－（经包装）污染走廊－外部区域。
九、注意事项：
1.防止病原菌的污染，要严格按照SPF级实验室规定操作.2.注意观察实验室的环境条件，保持环境温度，湿度等在规定的条件下。3.注意观察动物的活动状况，观察有无生病或死亡的.