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植物细胞凋亡研究概况
摘要: 细胞凋亡( programmed cell death) 简称PCD, 是一种由细胞内部控制的主动死亡行为。普遍存在于动植物生长发育过程中, 在个体发育、 环境压力以及与环境互作过程中起着极其重要的作用。植物细胞凋亡具有染色质固缩和边缘化、 DNA片断化、 核的降解、 质膜内缩、 大量囊泡的出现、 细胞壁的修饰等特征, 是由相关的基因、 蛋白酶以及细胞色素c介导和调控的。本文概述了植物细胞凋亡的分子机理、 凋亡特征和检测技术, 并对植物细胞凋亡存在的问题进行分析和展望。
Abstract: Apoptosis(programmed cell death) referred to as PCD, is an active death behavior controlled by the cell's internal. Generally exists in the growth process of animal and plant, which plays a very important role in the process of the individual development, environmental pressure and the environment interaction. Plant cell apoptosis with chromatin condensation and marginalization, DNA fragmentation, nuclear degradation, plasma membrane retraction, a large number of vesicles appeared, cell wall modification and other characteristics, is mediated and regulated by the related gene, protease and cytochrome c. This paper summarizes the molecular mechanism of plant apoptosis, apoptotic features and detection technology, and carries on the analysis and prospect on the existing problems of plant cell apoptosis.
细胞凋亡(细胞编程性死亡)是细胞的重要生命活动特征, 对于多细胞生物个体发育的正常进行, 自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用, 平衡及多种病理过程具有极其重要的意义。细胞凋亡的概念由Kerr[1]于1972年提出, 当时用来描述某些类型细胞在一定的生理或病理条件下, 遵循自身的程序, 主动地结束其生命, 最终脱落离体或裂解为若干凋亡小体而被其它细胞所吞噬的过程。细胞凋亡的主要特征包括: 染色质凝集、 质膜出芽、 核裂解及凋亡小体的形成。二十世纪九十年代, 在世界范围内广泛兴起对于细胞凋亡的研究, 并在动物细胞凋亡的机理研究中取得了重大进展。人们对植物细胞凋亡的研究起步较晚。Greenberg(1994)[2]等最早提出植物中存在程序性死亡的现象, 即植物受病原体侵染时, 自身的抗病基因被激活, 同时促使感病部位的细胞死亡, 抑制病原体的扩散, 这一现象称过敏反应(Hypersensitive Reaction, HR)。在过敏反应中可观察到某些与动物细胞凋亡类似的特征。近来已有不少证据表明植物细胞中存在凋亡的现象。许多植物在发育过程中发生的死亡现象, 如叶、 心皮、 花瓣的衰老、 木质部的发生、 湿地植物通气组织的形成、 糊粉层的消失等实际上都是程序性死亡。经过研究人们也发现许多诱导植物细胞凋亡的因素, 如病原体感、 热激、 维生素K3、 乙烯利、 外源细胞色素c、 羟自由基、 高盐等。人们发现植物细胞的凋亡具有某些与动物细胞凋亡相似的机制[3]。
1植物细胞凋亡的特征
细胞凋亡的形态学特征主要表现为细胞核固缩; 染色体凝集; 大多数细胞出现DNA片段化( fragmentation) , 经琼脂糖凝胶电泳出现梯形条带( DNA Ladder) ; 细胞骨架紊乱, 内质网起泡, 并与细胞膜融合, 形成细胞质气泡; 染色体段片、 细胞器和细胞质被细胞膜包裹, 形成凋亡小体。凋亡小体很快被巨噬细胞和邻近的细胞所吞噬, 由于死亡细胞的溶酶体酶无活性, 因此凋亡细胞的清除不会产生炎症反应。凋亡细胞表面皱缩并出现卷曲, 内质网扩张并出现火山口样的空腔, 空腔与细胞膜相融合。细胞凋亡过程中, 细胞的生化特性也发生改变, 例如一些蛋白酶被激活或抑制, 核酸内切酶激活等[4]。
2细胞凋亡的分子机理
2.1Caspase
Caspase蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease)是一类半胱氨基酸蛋白酶。它在动物细胞程序性死亡(PCD)中既是水解蛋白质的参与者, 也是细胞程序性死亡的启动因素。是动物PCD执行阶段的核心酶。它的活化直接导致凋亡细胞的解体。在植物衰老的早期, 一些衰老相关基因的表示产物与Caspase有一定的同源性。已有证据表明植物细胞凋亡过程中也发生类似caspase的活化[5]。Olga等[6]用caspase特异性抑制剂Ac—YVAD—CMK(caspase一1抑制剂)和Ac—DEVD—CHO(caspase～3抑制剂)消除了烟草的细胞凋亡, 第一次在细菌诱导的烟草细胞中检测到类似caspase的活性, 表明caspase的活化对细胞死亡起了重要的作用。Anke等[7]在化学物质喜树碱、 星形孢菌素、 串珠镰孢菌素诱导的番茄悬浮细胞凋亡中也发现了caspase一1和3的活性。酸蛋白酶大量特异表示。在衰老过程中。植物半胱氨酸蛋白酶在蛋白质的水解和氮的重复方面可能起着重要的作用, 植物半胱氨酸蛋白酶参与了植物的衰老、 生物和非生物胁迫引起的细胞程序性死亡．植物半胱氨酸蛋白酶在功能上均类似于动物细胞中的Caspase家族蛋白酶。
动物细胞凋亡过程中, 细胞色素C由线粒体向细胞质中释放, 是Caspase-3活化的必要条件。研究发现, 植物细胞凋亡的早期, 同样也发生细胞色素C从线粒体中释放。在凋亡诱导因子作用下, 植物和动物细胞的线粒体均释放出细胞色素C, 表明这条源自原始单细胞死亡的途径在进化过程中是保守的。
2.2活性氧
植物被病原菌感染后, 活性氧(Reactive oxygen species, ROS)在植物被侵染位点急剧增加, 称为氧爆发, 这种氧爆发现象在对病原菌敏感或抗性的植物体内都存在。但在抗性植物体内, 植物被感染后一定时间内活性氧持续增加．并伴随超敏反应(HR)和细胞凋亡现象。另外, 当植物生长的环境条件如温度、 湿度、 土壤中的水分、 盐浓度等发生急剧变化, 或当大气污染、 紫外线辐射等。均会使植物体内产生大量的活性氧, 形成氧化损伤, 在某一特定条件下产生细胞凋亡。这些比氧活泼的含氧化合物包括: 超氧阴离子(O:一)、 氢氧根离子(OH一)、 自由基(·OH)、 H2O: 等。许多资料表明O2一是引细胞死亡的关键性活性氧．其在细胞死亡之前和死亡区域的周围细胞中大量积累。O2一在细胞死亡之前先在某一位点积累．随后向相邻的活细胞扩散, 引起周边HR细胞损伤[8]。用超氧化物歧化酶处理TMV感染的烟草叶片能抑制HR的发展．则进一步证明了O2一的清除作用。外源病菌入侵后, 导致植物体中氧化态物质突发性释放, 大量产生O2一 和H2O2等活性氧中间体, 从而引发防御基因的表示及限制细胞的死亡。病原体还能激发远处未感染组织细胞发生次级氧化态突发, 产生低频系统微过敏发应。初级和次级氧化态物质突发性释放激活植物的防御性反应, 对于植物的系统抗性是必须的。这与动物中巨噬细胞经过吞噬泡中高浓度的活性氧杀死入侵细菌的方式相似。当前, 人们普遍认为, 活性氧与植物细胞的程序性死亡有关: 在植物的PCD过程中活性氧可能起到三方面的作用: 一是低浓度时作为信号分子传递环境胁迫信号; 二是中等浓度时能诱导细胞发生PCD; 三是高浓度时细胞发生坏死。[9]
2.3乙烯
乙烯在高等植物叶、 花的衰老、 果实成熟等过程中起着重要调控作用。最近的研究显示, 乙烯在植物PCD中也起重要作用, 虽然也可能存在着不依赖于乙烯的 PCD。例如, 缺氧诱导的玉米根皮质部气生组织形成过程中, 乙烯经过增高胞内Ca2+浓度, 引起细胞凋亡, 导致气生组织的形成。Young等[10]也发现在小麦胚乳中, 乙烯的浓度能够部分地调节核内DNA的降解。提高乙烯浓度能够使DNA降解提早出现, 而抑制乙烯的浓度能够降低或延缓DNA降解。因此乙烯诱导Ca2+重新分布可能是诱发植物PCD的机制之一。另外, 由于GA也能刺激PCD．乙烯和GA的联合效应又可被CTK及ABA所逆转, 因此, 乙烯很可能与其它信号分子协同作用来控制PCD发生。
2.4与凋亡相关的基因
2.4.1 BEN1和ZEN1基因 BEN1是大麦中分离的编码一个35KD的核酸酶的基因, 其产物含有288个氨基酸残基, 推测含有23个氨基酸的信号肽。BEN1蛋白可能与胚乳退化过程中发生的PCD有关。ZEN1是从百日草( zinnia) 分离的编码一个43KD核酸酶的基因。其产物由303个氨基酸组成, 推测含有一个25氨基酸残基的信号肽。ZNK1可能在导管的分化中发挥作用[11]。BEN1与ZEN1的氨基酸顺序同米曲霉( Aspergillus oryzae) 的S1核酸酶有很高的同源性。
2.4.2 Pto基因 Pto基因是番茄中的抗病基因, 编码一类丝/苏氨酸蛋白酶, 属于一个多基因家族, 经过识别病原体Pseudomonas syringae pv tomato上相应的avrPto, 激活下游的信号转导途径而起到抗病的作用。用酵母双杂交系统, 以Pto的ORF为引诱基因, 发现了作用于其下游的另一个丝/苏氨酸蛋白激酶Pti。Pti含370个氨基酸残基, 在体内可被Pto磷酸化。将全长的Pti cDNA在35S启动子的带动下, 经过TMV导入烟草中, 其过度表示可加速烟草中由带有avrPto基因的Pseudomonas syringae诱导的HR[12]。
2.4.3 hsr203、 Lehsr203基因 hsr203是烟草基因, 其活性出现于烟草与病原体相互作用之时。Hsr203启动子与GUS的融合基因在烟草中可被细菌或病毒病原体诱导表示, 表明它与烟草HR中的PCD有关[13]。Lehsr203是hsr203在番茄中的同源体。
2.4.4 lls1 lls1(lethal leaf spot 1) 是植物成熟叶片中能够抑制细胞死亡扩展的基因。玉米中的lls1编码一个在植物中高度保守的58KD的蛋白[14]。推测的lls1蛋白含有两个保守的结构基序: 一个硫铁结合位点, 一个不含血红素的铁结合位点。这两种结构基序也存在于芳环羟化过氧化物酶中, 因此推测lls1编码产物可能作为过氧化物酶, 经过降解介导细胞死亡的酚类物质而起作用。
2.4.4 mlo 大麦中的抗病基因mlo(mutation-in-duced recessive alleles), 对真菌Erysiphe graminis f.sp. hordei的侵染具有抗性。 等位基因能够使真菌侵染的植物在侵染部位形成细胞壁基质沉积。mlo1、 mlo3、 mlo5突变体即使在无真菌侵染的情况下, 也能够诱导植物细胞壁沉积。 mlo基因含有12个外显子, 有一个1599bp的开放阅读框架, 推测的编码产物为60KD, 是至少含有6个跨膜螺旋的跨膜蛋白[15]。mlo蛋白在植物叶片死亡及病原体防御中起负调控作用。
3 检测技术
3.1 多聚ADP核糖聚合酶降解情况检测法
多聚ADP核糖聚合酶( PRPP) 在DNA修复中起着重要作用, 它是caspase-3的底物, 近年来有不少证据证明PRPP的降解是植物细胞凋亡的特征之一。PRPP被caspase-3水解后形成相对分子质量分别为85000及25000的2个片段, 用运载相对分子质量为85000片段的抗体能够观察细胞是否发生凋亡[16]。
3.2 酶联免疫吸附法
本方法基于凋亡细胞内裂解的DNA片段含组蛋白( 核小体) , 而DNA与组蛋白结合紧密而不被核酸内切酶切割。在微量板上吸附抗组蛋白抗体, 加入细胞裂解后离心所得的含有核小体的上清液, 核小体上的组蛋白与被包被的抗组蛋白抗体结合; 加入辣根过氧化物酶标记的抗DNA抗体, 与核小体上的DNA结合[17]; 加酶的底物, 测光吸收值。该法敏感性高, 所需细胞少, 可检测到5×102 /ml的凋亡细胞, 但缺点是不能定位。
3.3 细胞色素C释放的检测法 在动物细胞凋亡中, 线粒体的细胞色素C释放到细胞质中, 在ATP或dATP作用下可特异地与胞质接头蛋白APaf-1结合并促进APaf-1寡聚化, APaf-1可选择性地直接结合caspase-9, 形成凋亡体复合体, 并引起caspase-9的活化, 从而激活下游分子诱导凋亡。在植物细胞凋亡的初期也检测到细胞色素C的释放, 因此也能够用细胞色素C的释放情况作为检测细胞凋亡的手段。首先提取细胞质和线粒体的蛋白质, 在SDS-聚丙烯酰胺凝电泳后将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上, 与细胞色素C的初级抗体进行杂交, 洗去非特异性结合的抗体后再与二级、 三级抗体杂交, 最后经过碱性磷酸酶显色反应显示该蛋白的存在[18]。向拟南芥根和悬浮培养的玉米细胞培养基中添加D-甘露糖, 细胞发生凋亡, 同时发生细胞色素C从线粒体中的释放。
3.4 caspase活性检测法 caspase(胱冬酶) 是一类半胱氨酸蛋白酶, 同时具有半胱氨酸和天冬氨酸裂解位点, 它已被证明在动物的细胞凋亡中起着极其重要的作用, 在植物中有可能也存在此类物质。因此, 能够把检测caspase的活性作为检测细胞凋亡的辅助手段。Thornberry等建立了caspase活性的测定方法, 底物Ac-YVAD-AMC在该酶作用下被分解释放出7-氨基-4-甲基香豆素(AMC), 产生黄绿色荧光, 可经过荧光分光光度计于460nm处进行检测。
4展望
细胞凋亡是植物生长发育的一个基本组成部分。如, 根、 茎、 叶、 花、 果等的死亡注定会在生活史的特定阶段发生。植物某器官的凋亡对植物体有着重要的生物学意义。从个体发育的角度来说, 叶片衰老是适应营养重新分配的生物现象, 可是这个过程却对农产品的产量产生负效应。Gan等建立的植物衰老抑制体系为提高农产品产量提供了重要思路。另外, 了解植物生长发育过程中正常的细胞凋亡现象, 而且将其在谷物、 蔬菜的贮存和果实、 鲜花的保鲜中加以利用, 对提高农产品的品质和质量有深远意义。
部分细胞凋亡相关蛋白具有保守性说明它们在高等植物进化与起源上有重要意义。研究表明, 有些动植物细胞凋亡相关蛋白具有多个保守的结构域, 如TNFR(肿瘤坏死因子受体)、 Ap—ATPases(凋亡ATP酶)、 CDK(依赖细胞周期蛋白的激酶)、 CKI(CDK抑制子)和Caspase(一种半胱氨酸蛋白酶, 植物中也存在类似Caspases的蛋白酶), 这些保守的结构域的进化引起细胞凋亡的起源和进化[19]。细胞凋亡相关蛋白的结构域的进化向两个方向进行①垂直遗传(vertical inheritance), 如哺乳动物TRAF(TNFR相关因子)的结构域在网柄菌属(Dietyostelium)中存在同样的结构域, 以保证同种反应(homophilic interaction)的准确性; ②水平遗传(horizontal inheritance), 如Ap—ATPase家族的结构域在动植物、 放线菌中均各自独立进
化, 出现反应的多样化, 但其主要功能保持不变[20]。因此, 研究这些保守结构域的进化对于彻底弄清动植物细胞凋亡进化具有重要意义。
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