中药材DNA及重金属快检技术研究.pdf

摘要目的：本课题通过对中药材炮制品DNA快速提取、快速PCR扩增以及重金属含量快 速检测技术进行研究，建立了中药材真伪及重金属含量的快速质量评价体系中的中药 材真伪鉴别及重金属含量检测，为满足中药鉴别现场运用系统的快速、简单、低毒、高效、灵敏等要求提供技术支撑。方法：L以氢氧化钠，1%PVP4O和l%TritonX-100配制成碱裂解缓冲液，TrisHCl 为中和液，经加热裂解和中和两步对地黄酒炙品、槐米炒制品以及加入辅料的炮制品 进行DNA提取并进行PCR扩增。在该提取方法的基础上,选择试剂盒法和Chelex-100 法对槐米炒制品DNA进行纯化，用通用引物进行PCR扩增。2.通过对西红花及其 常见掺伪品的叶绿体基因片段psbA小H测序和比对分析，找出序列差异，针对差异 碱基设计特异性引物，构建PCR扩增反应体系，通过优化PCR反应退火、变性温度 及时间，减少循环数等条件，选择高效的DNA聚合酶，缩短PCR反应时间，在PCR 产物中加入SYBR Green I荧光染料，代替凝胶电泳步骤。3.使用不同金属离子与探 针反应，确定两种探针的选择性。使用不同浓度铜离子溶液与两种探针反应，根据铜 离子浓度与荧光强度值作出标准曲线，测定药材粉末的待测液与Probe混合液的荧光 强度值，计算出药材粉末中金属离子含量。同时通过ICPMS和紫外分光光度法分别 测定该批次药材中的铜离子含量与总重金属含量与探针测量结果比较。结果：L优化碱裂解法可简单快速的提取出地黄酒炙品、醋炙延胡索、酒炙当归、盐炙补骨脂、孰炒苍术等药材的DNA。槐米炒制品提取DNA浓度为420.61123.91 gg-pL-1,但槐米炒制品在炒制温度高、时间长的情况下，很难扩增出明显PCR条带，通过使用5%Chelex-100树脂纯化后即可获得明显扩增条带。2.建立了基于 psbA-tmH序列的西红花快速真伪鉴别体系，优化后的PCR反应条件为90预变性1 min,90C变性5 s,58c延伸5 s,26个循环。在PCR反应产物中加入染料SYBR Green I,西红花正品出现强烈绿色荧光，而伪品无荧光。3.荧光探针B是针对于CW+的特 异性荧光探针。Probe B与不同浓度铜离子混合后，铜离子浓度在0.62.4 mg/L范围 内显绿色荧光，当浓度大于2.4 mg/L时，绿色荧光淬灭。在0-2.4 mg/L范围内铜离 子浓度与荧光强度比值的标准曲线为y=64395x60247,根据该曲线得出的铜离子 浓度与ICP-MS测出的铜离子浓度进行比较，作出曲线y=4.8471x4921,据此可以得 出药材中的铜离子含量。4,荧光探针A是针对与总重金属离子的含量测定的荧光探 针。Probe A与不同浓度铅离子混合后均显蓝色荧光，在04.0mg/L范围内铅离子浓 度与荧光强度比值的标准曲线为y=0.1165X+0.5413,根据该曲线得出的铅离子浓度 与紫外分光光度法测出的总重金属含量进行比较，作出曲线y=l.2335x+28.355,据 此可以得出药材中的铜离子含量。万方数据结论：优化碱裂解法能够快速、安全的提取中药材炮制品的DNA；位点特异性PCR 方法可以简单快速的鉴别药材真伪及其掺伪品；荧光探针技术可以快速的测量出药材 粉末中铜离子与总重金属的含量，测量过程简便、快速。通过以上方法可以简便、快 速、直观的对药材真伪以及质量进行鉴别。关键词分子鉴定；碱裂解法；特异性PCR；重金属快检；荧光探针万方数据Rapid detection technology research of DNA and heavy metals inChinese medicinal materialsAbstractObjective:This study is about the DNA、PCR amplification and heavy metals rapid detection technology of Chinese medicinal materials.In order to meet the operation system that traditional Chinese medicinal materials(TCM)identify is rapid,simple,low toxicity,high efficiency and sensitive through a rapid method to extract DNA,PCR amplification and detection of heavy metal content.Method:1.The alkaline lysis buffer was made of soduiumhy droxide,1%PVP and 1%TritonX-100,and Tris-HCl solution was neutralized,through the two steps of heat cracking and neutralization to extract DNA from processed products of difierent making methods the preparation of traditional Chinese medicine.On the basis of the extraction method,the kit and Chelex-100 method were used for sophora japonica Fried products DNA purification,then universal primes were used for amplifying PCR.2.The chloroplast barcode was sequenced and analyzed to find the SNPs between Crocus sativus L.and its adulterants.Specific primers were designed for the SNPs,the PCR reaction systems were built and optimized through PCR reaction annealing,denaturation temperature and time,reducing the cycle number and efficient DNA polymerase,and fluorescent dyes method was used to identify PCR products instead of gel electrophoresis.3.Throughing the different metal ions and the probe recation to determinedetermined the selectivity of two probes.According to the copper ion concentration and fluorescence intensity,the standard curve was made,andthe metal ion content in the medicinal powder was calculated by the standard curve.At the same time the copper ions content in the batch herbs and total heavy metal content were determined by ICP-MS and ultraviolet spectrophotometric method.Result:1.The results indicated the optimized alkaline lysis method of extacting the DNA from processed products of different making methods the preparation of traditional Chinese medicine can be quick and easy.DNA concentration extracted from the different processed sophora japonica was 420.61123.91|ig4iL.Using 5%Chelex-100 resin purification,obvious amplification bands can be obtained.2.A421bp saffron identification band based on the psbk-trriH barcode sequence was screened,when 100 x SYBR Green I was added in the optimized PCR product under the certain condition that 90 initial denatured 1 min；90*C denatured 5 s,58 annealing 5 s,30 cycles;the Crocus sativus L.appeared strong green fluorescence under 365 nm UV lamp whereas adulterants were not.Quick and reliable molecular identification method to saffron was established.3.The 万方数据specificity of the fluorescent probe B is for Cu2+.The Probe B mixes with different concentrations of copper ion,when the concentration is greater than 2.4 mg/L,the green fluorescence quenching,the concentration is under than 2.4 mg/L,the mixed liquor show green fluorescent.The standard curve was y=6.4395x-6.0247 within 0-2.4 mg/L of copper ion concentration with fluorescence intensity ratio.The correlation between the curve of copper ion concentration and ICP-MS measure of copper ion concentration is the curve y=4.8471 x-0921，and the copper ion content in medicine can be calculated.4.The specificity of the fluorescent probe A is for total content of heavy metal ions.The Probe A mixed with different concentrations of heavy metal ions are blue fluorescence.The standard curve wasy=0.1165x+0.5413 within 0 to 4.0 mg/L lead ion concentration and fluorescence intensity ratio.The correlation between the curve of lead ion concentration and ultraviolet spectrophotometry measure of heavy metal ions concentration is the curve y=1.2335x+28.355,and the heavy metal ions content in medicine was calculated.Conclusion:It is illustrated that the optimize dalkaline lysis method of extacting the DNA from Chinese medicinal products can be quick and easy;Rapid molecular identification of saffron results indicated that the fast site-specific PCR was simple and rapid identification on the Crocus sativus L.and its adulteration;Fluorescent probe technology was simple and rapid to measure the content of copper ions and total heavy metals from the Chinese herbs.It can be simple,fast and intuitive to identify medicinal authenticity and quality through the above methods.Key words:molecular identification;alkaline lysis;Specific PCR;rapid detection of heavy metal content;fluorescent probeAuthor:Zheng qi Tutor:Huang Luqi万方数据目录引言.1第一部分研究背景.2L中药材快速分子鉴定.21.1 DNA快速提取方法研究.21.2 快速PCR技术研究.32.重金属快速检测技术.42.1 中药材中重金属检测方法.52.2 荧光标记在重金属检测中的应用.73.本课题研究的目的及意义.10第二部分中药材快速分子鉴定技术研究.111.基于碱裂解法的药材炮制品DNA提取方法研究.111.1 地黄酒炙品的DNA提取.111.2 槐米炒制品的DNA提取及其条件优化.13L3不同炮制品的DNA提取.17L4小结.182.基于特异性引物的西红花快速PCR技术研究.192.1 仪器与材料.192.2 方法.2023结果.222.4 小结.263.结果与讨论.26第三部分中药材重金属优检技术研究.281.仪器与材料.282.方法与结果.282.1 ICP-MS测定药材中重金属含量.282.2 紫外分光光度法测定药材中重金属含量.302.3 重金属快检技术研究.32万方数据3.结果与讨论.39第四部分结论与讨论.40参考文献.42附录.47附图.48致谢.49万方数据中药材DNA及重金属快检技术研究引言中药材质量的根本问题是药材品质的真伪优劣。由于中药紧缺品种较多以及部分 贵细药材的价格昂贵，因此有些不法分子为了牟取暴利，趁机伪造掺假，加之有中药 技术人员收假用错，使得中药材市场混用现象严重，中药材滥用、误用现象屡见不鲜,严重影响人们用药安全以及我国中药质量。因此对于中药材的品种混乱现象，必须进 行澄清，特别是中药材的真伪及掺伪品鉴别实为当务之急。传统的中药材鉴定方法包含基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定及理化鉴定。各种鉴 定方法均有其特点和鉴别对象，对检验品的要求也各不相同。自从分子生物技术的产 生及发展，根据遗传物质在不同个体之间的差异来鉴别生物物种，从而揭示鉴别物种 之间的亲缘关系，达到鉴别生物体的目的。分子鉴别方法在中药材品种快速、简便的 鉴别中将发挥重要作用。影响中药材质量的另一问题是中药材中重金属超标。患者服用被重金属污染的中 药材之后，重金属会在人体内累积，因中药的药效缓慢，因此一般治疗周期较长，如 果长时间服用被重金属污染的中药材，其重金属会在人体内累积达到一定的量之后，会表现出相应的毒副作用，进而引发疾病，甚至还会危及人们的生命安全。如何快速、简便的检测出药材中重金属含量是否超标对于人们用药安全具有重大的意义。传统的重金属检测方法首先需要对药材进行前处理，保证其完全消解；然后对其 测定含量。这个过程中用时较长且操作步骤繁琐。近年来发展出一些快速检测重金属 含量的方法，如酶免疫法、荧光探针标记法、生物传感器法等，这些方法均可以快速 的定性或定量的检测出药材中重金属。目前已被广泛生物应用于各个方面。由于中药材真伪以及质量问题直接关系人们的用药安全及药物疗效，如何能够在 产地、市场等进行现场快速鉴别药材的真伪以及药材的重金属含量是否超标对人们的 用药安全具有现实意义。1万方数据陕西中医药大学2015届硕士学位论文第一部分研究背景L中药材快速分子鉴定我国中药材种类繁多，资源丰富，然而其来源复杂，品种易混淆。随着分子生物 技术的高速发展，根据遗传物质DNA在不同生物个体的差异来鉴别生物物种，从而 揭示不同品种间的亲缘关系，为鉴别药材品种提供依据。但大多数药材多是不新鲜 的，且经过炮制后方能入药，因此DNA会有一定程度的降解，给中药分子鉴定带来 困难。Mullis等人在1985年发明了聚合酶链式反应(PCR)技术，使痕量的DNA扩 增到足以供实验人员方便进行检测与分析的数量。PCR现已成为分子生物学研究中 的最基本和普遍手段之一。与传统中药鉴定方法相比，中药分子鉴定具有准确性高、重现性好等特点，且不受样品形态的限制。但目前分子鉴别技术难以实现在产地、药市等进行现场鉴别，极大的限制了其使用的范围和推广程度。因此如何能够快速、简便、准确的进行DNA提取和DNA标记是实现中药材分子鉴别现场运用的关键问 题叫，1.1 DNA快速提取方法研究CTAB法和SDS法是提取DNA常用的方法。CTAB是一种阳离子去污剂，它能 与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液中可解离，使DNA和多糖分开，用乙醇 沉淀DNA而除去CTAB。在该法中使用的聚维酮(PVP)与多酚结合形成复合物，可有效避免多酚类化合物使DNA降解网。SDS(十二烷基苯磺酸钠)是一种阴离子 去垢剂，高温条件下能裂解细胞，与蛋白质、多糖形成复合物，释放出核酸，该复合 物在高盐低温下溶解度变小，从而可使蛋白质与多糖杂质离心除去，上清液中DNA 可用酚/氯仿抽提法获得。上述两种提取方法能够获得高纯度的DNA,满足各种实验 要求，但操作繁琐，用时长，且所用酚、氯仿等有机试剂有一定的毒性，并不能满足 中药分子鉴别现场运用的快速的要求。1.1.1 碱性裂解法碱性裂解法是指样本在强碱性条件及一定温度下能迅速破碎细胞膜及核膜，释放 DNA叫其DNA提取只需一个离心管，一次完成，操作简单、快捷，被认为是一种 有效的DNA快速提取方法，已广泛应用于小麦、花生、水稻、玉米等方面【&刀。蒋超 等冏建立了针对中药材的DNA提取的碱性裂解法，操作过程为：将药材粉末加入溶 液裂解液后震荡1 min,再加入中和液震荡1 min,静置后取上清待用。笔者利用这种 方法对市售的180余种药材包括炮制品药材进行了 DNA提取，并使用通用引物进行 PCR扩增同时凝胶电泳检测。结果表明85%药材DNA获得了 PCR扩增条带，但炮 制的药材PCR成功率明显降低。2万方数据中药材DNA及重金属快检技术研究1.1.2 Chelex-100 法Chelex-100树脂可以高选择的结合金属阳离子，并用于去除样品和缓冲液中的金 属阳离子，阻止DNA进一步降解；能有效的去除非核酸有机物；且螯合金属离子的 Chelex100颗粒也可以通过离心去除，不影响PCR反应网。Chelex.100适合于当检 材较少或基因分型只需要少量的DNA的提取，目前广泛应用于医学微量血痕 DNAU。】、血液制品污染细菌DNA1”】、植物转基因检测模板DNA的制备叫蔡翠霞【等通过改良Chelex-100法提取转基因农产品的DNA,获得清晰明亮的条带，其操作 基本过程为：将10%Chelex-100缓冲液加入样品粉末中，保温30min,震荡混匀，煮沸15 min,震荡混匀，离心取上清液待用。笔者将该方法与传统CTAB提取方法 比较，PCR扩增效果基本一致。1.1.3 磁珠法Danies3等和Taylor等发现在高浓度的盐溶液中，基因组DNA可以吸附在氧 化硅表面，在水溶液中DNA又可以重新析出，他们利用氧化硅磁珠成功提取了质粒 DNA及玉米籽基因组DNAo磁珠法是利用裂解液将细胞迅速裂解并使核酸酶失活，释放基因组DNA,然后基因组DNA选择性吸附于磁珠，经过一系列快速的漂洗分 离步骤，除去细胞代谢物、蛋白等杂质，最后用双蒸水将基因组DNA从磁珠上洗脱 即可。卢瑛I等建立了一种以磁珠法为基础的基因组DNA快速提取方法，整个过程 只需要12 min。其操作过程为：将样本和磁珠悬浮液混匀后室温反应5 min,用磁分 离架回收磁珠，分别加洗涤液和乙醇洗涤后，烘干，加入适量灭菌水溶解待用。表1：以上三种快速DNA提取方法的比较：碱性裂解法Chelex-100 法磁珠法样本需求量中等中等微量提取时间5-20 min30-90 min30-120 min操作步骤少少较多换管次数无无中等试剂成本低中等磁珠较高试剂毒性无无低中药材分子鉴别现场运用的关键问题是快速、简便、准确，此外，一般尽量选择 提取DNA质量高、试剂成本低、所需仪器方便携带的方法。因此，如何能够快速、简单的提取基因组DNA已成为亟待解决的问题之一。1.2 快速PCR技术研究PCR（Polymerase chain reaction：聚合酶链式反应）即是在体外模拟体内DNA复 制的过程，用一对寡核甘酸引物，通过变性一退火一延伸这一周期的多次循环，使目 3万方数据陕西中医药大学2015届硕士学位论文的DNA片段得到扩增I。目前PCR技术已成为分子生物学实验室的一项基本技术。PCR扩增结果与以下因素有关：模板DNA质量，周期循环次数及反应效率。其 中反应效率的影响因素为DNA聚合酶活性及浓度，dNTP浓度，引物识别效率及浓 度，各反应周期及其各个子过程的持续时间和温度等。一个常规的PCR扩增程序为：预变性5 min,变性30 smin,退火30 s-1 min,延伸1 min（30个循环），72延伸7min。一个完整的PCR扩增程序大约需要1-3 个小时，这严重影响工作效率。难以满足现场快速检测的快速的要求。许多学者一直致力于该技术的开发和改进工作，为了提高PCR的实验效率、节 约成本。Yap等网在1991年通过更改PCR条件缩短PCR反应时间。而Wittwer等口8。通过使用毛细管进行PCR反应，即利用热空气注入法快速控温，从而减少升降温的 时间，使得30个周期的循环能够在30 min内完成mi。Wittwer教授在二十世纪九十 年代时提出，他认为只有在30 min内完成30个周期循环的PCR扩增，才可称之为 快速PCR（Rapid PCR）,目前该定义已被广泛的接受认可。在常规PCR原理的基础上来建立快速PCR技术，因此要实现快速PCR检测方 法包括以下几种策略：（1）改变PCR程序，缩短变性退火延伸周期的持续时间或温 度变化时间磔刈。（2）提高聚合酶的延伸活性和延伸速率。（3）改进PCR仪的升降 温速度，即增加热传导率四】。现今商品化的快速DNA聚合酶已经成熟，但常规PCR 仪在较长的一段时间里依然会是主流仪器，因此通过优化PCR程序在常规PCR仪上 进行快速PCR技术将成为中药快速PCR鉴别的一个研究方向。2.重金属快速检测技术重金属通常是指比重大于5 g cm-的一类金属元素，如铜、镉、金、银、铅、锌、银、钻、铭和汞等【24】。但随着城市化工业化进程的加快，环境污染日益加剧，工 业三废、城市生活垃圾、污泥的排放、含重金属的农药化肥的不合理使用等，使中药 材重金属含量日益增高，中药材品质降低，严重危害人体健康。重金属对人体危害表 现在重金属可以通过空气、水、食物等渠道进入体内，与体内有机成分、蛋白质、核 糖、维生素、激素、生物酶等结合成或反应，使其丧失或改变了原来的生理化学功能 而产生病变或表现出毒性磔-2刀。中药材质量的好坏，会直接影响到患者的安全和疗效。近年来，我国发生了多起 中药材重金属超标事件。德国从我国进口的大批中药饮片中，30余种药材中重金属 含量超标的多达11种，其中川苜6次检验均重金属超标2叫重金属含量超标事件已 成为国际医药市场的热门话题。因此，世界各国、地区、组织等对中药材中的重金属 含量进行了严格控制。2001年7月1日我国国家对外贸易经济合作部出台和实施了 药用植物及制剂进出口绿色行业标准画规定了药用植物及制剂的绿色品质标准。4万方数据中药材DNA及支金属快检技术研究2.1 中药材中重金属检测方法2.1.1 重金属传统检测方法传统的重金属检测方法在测量中药材的重金属含量之前，先对样品进行适当的前 处理。保证样品完全消解。通过查阅相关文献，目前常用的样品前处理的方法主要包 括以下几种：(1)灰化法是将样品先炭化，再高温灰化完全，用强酸溶解灰分，定量 转移。该法设备简单，操作简便，但耗时且样品不易被灰化完全。楼小红网等对杭白 芍和亳白芍采用灰化2h后，测定其重金属含量。(2)将样品置于聚四氟乙烯瓶中，加入强氧化性酸，置入烘箱中，20(TC左右保持33h。该法操作简便，但耗时长且对 设备要求较高。胡曙光即等采用压力罐消解法测定食品中铝离子的含量。(3)湿式消 解法是使用氧化剂在一定温度下将样品中的有机物进行分解。该法简便、重复性好，但污染大、耗时长。实验室常用的氧化剂有硝酸(HNCh)、过氧化氢(H2O2)、高氯酸(HC10。等。高广飞卬等采用该方法测得菠菜中总碑的含量。(4)微波消解法是指将 样品放入密闭容器中利用微波快速加热使样品分解。其具有完全、快速、低空白的优 点，但同时也由于高压可能带有的过压的隐患，同时消化样品量较小。王彩艳同等采 用该方法测定枸杞子倍的含量。近年来常用的传统重金属检测方法如下：(1)紫外分光光度法是将药材中待检测 的重金属元素与显色剂反应后在紫外下检测有吸收，以此来测定药材中重金属含量。该法操作简便、快速、重现性好。李可采用紫外分光光度法测定红花中的重金属含 量，加标回收率为97.82%。(2)电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)于2005版中 国药典被收录用于测量铜、镉、汞、铅、珅的测定方法之一。该法利用电感耦合等 离子体使样品汽化后使待测离子分离出来后进行测定。该法具有极地的检测线、动态 线性范围宽、多元素快速分析、便于与其他进样技术连用等优点。贾薇网等采用 ICPMS法测定5种中药材中铜、碑、镉、铅等重金属含量，结果测定样品回收率为 92.3%-108.0%,该方法简便、快速、准确，为中药材的质量控制及临床用药安全提 供了科学依据。(3)高效液相色谱法(HPLC)是利用痕量金属离子可与有机试剂形 成稳定的有色络合物，然后将各成分于色谱柱内分离，用检测器检测可实现多元素的 同时测定。但络合剂的选择有限，因此该法在重金属含量测定方面有一定的局限性。吴献花阈等采用高效液相色谱法测定食品中银、铜、锡、铅、镉、汞的含量，平均回 收率为95%105%,该法对于痕量重金属元素的测定提供了很好的依据。(4)原子 荧光光度法(AFS)是利用激发光源照射待测元素的原子蒸汽，使其产生荧光，根据 荧光强度来测定待测元素的含量的一种分析方法。邹亮卬】等采用湿法消解.原子荧光 光度法测定滇重楼中碑、铅、汞、镉的含量，平均回收率为99.08%101.08%,该法 检测药材重金属含量对于药材的质量评估提供参考依据。(5)原子吸收光谱法(AAS)利用不同的方法使待测物质原子化。根据各元素的性质以及原子化方法的不同，将原 子吸收光谱法分为火焰原子化法，非火焰原子化法，石墨炉原子化法。将该三种方法5万方数据陕西中医药大学2015届硕士学位论文的特点总结如表12。表12：原子吸收光谱法三种方法的比较：火焰原子化法非火焰原子化法石墨炉原子化法原理化学火焰使物质分解石墨管高温使样品在室温至摄氏几百度的条并原子化原子化件下使样品原子化操作步骤简便一般简便灵敏度一般高高成本中等石墨管昂贵中等缺点原子化效率不高精密度差，化学干可检测元素种类少扰多上述传统的重金属检测方法应用广泛，虽然能够以较高的灵敏度对药材中的重金 属含量进行有效分析，但这些方法均需要先对样品进行前处理，分析时间长；且需要 大型仪器，使得分析成本提高，难以满足中药材重金属的现场快速检测。2.1.2 重金属快速检测方法近年来对于重金属快速检测的方法随着生物化学技术的发展而发展迅速。其中大 部分快速检测方法对于待测离子只能进行定性或半定量的检测，但这些方法操作简 便、成本低廉、检测快速，因此非常适合现场快速检测。2.1.2.1 酶分析法酶分析法是利用重金属与酶活性位点上的疏基或者甲疏基结合后，改变了酶活性 中心的结构和性质，从而建立起重金属浓度与酶系统变化之间的定量关系【38】。重金属 离子与特定的酶结合时，会产生相应的变化，如显色剂颜色、导电性、吸光度及PH 值得变化。这些变化可以通过肉眼观察、电信号或光信号的传输、PH值检测而获得，根据这些结果可以得出重金属元素及含量。目前，广泛应用于重金属快速检测的酶有 服酶【39,40、过氧化氢酶阴、胆碱酯酶冏、氧化酶阀等。华银峰等系统的研究了重 金属、缓冲液类型及其浓度对服酶抑制率的影响，为服酶抑制剂在重金属快速检测中 提供了坚实的理论依据。Yunhui45等采用胭酶抑制剂法测定Hg2+的含量，检出限为 lOgg/Lo2.1.2.2 免疫分析法免疫分析法是将重金属离子与合适的络合物或其他化合物结合，使其具有一定的 空间结构，产生反应原性，然后将结合了金属离子的化合物连接到载体蛋白上从而产 生特异性抗体，通过检测系统对该抗体的分析得出重金属元素及其含量。该方法的关 键在于与金属离子结合的化合物能否制备出特异性抗体。Johnson闸采用荧光偏振免 疫检测（FPIA）成功构建了检测镉离子的螯合物曲线，检测限为11.24|ig/L,同时他 6万方数据中药材DNA及重金属快检技术研究们还利用该方法测得了铅离子浓度，检测线达到1阳区147。牛涛网利用竞争ELISA 的方法检测金属汞离子含量，检出限为Ijig/L,具有比较宽的PH检测范围。虽然该 方法具有高特异性和高灵敏性的优点，但金属离子的单克隆抗体的制备非常困难。这 使得免疫分析法的研究和发展受到很大的限制。2.1.2.3 生物化学传感器法生物传感器是利用特定的生物识别物质与重金属结合，通过信号转换器将变化转 变为可检测到的光信号或电信号，以此来分析判断重金属元素及其含量。常用的生物 传感器包括有酶生物传感器、微生物传感器、细胞传感器、DNA传感器等。Ibrahim图】等采用耐热乳酸脱氢酶生物传感器来检测样品中的Hg2+,该生物传感器适用于含汞 和镇的溶液中的汞的检测。汤琳阿等提出一种新型葡萄糖氧化酶生物传感器用于测定 环境样品中Hg2+,检出限达到0.49ug/L,将其应用于土壤浸出液重金属的检测，回 收率为88%112%。化学传感器是对特定的待分析物质以化学反应的选择性方式产 生响应，从而对待分析物质进行测量】。化学传感器包括有电化学传感器、荧光传感 器、光纤维传感器等。欧国荣倒等以树脂为基质基于二苯碳酰二脚法制成光纤传感器 用来检测CN,其最低检测限为40jig/L,该法适合于野外检测。2.2 荧光标记在重金属检测中的应用荧光探针（fluorescentprobe）是一种选择性与特定分子或离子结合的分子体系。利用探针与被分析物质结合前后的颜色变化、光谱移动、荧光强度的增减等变化来对 被分析物质进行识别及检测。由于荧光探针检测技术具有价廉、简便、快速、灵敏度 高等优点，其已广泛应用于重金属检测、环境检测、生命科学等匿56领域。荧光探针主要包括三部分：荧光基团，识别基团，连接体。荧光探针与分子离子 的结合主要有4种响应机理：（1）光诱导电子转移（PET,photo-induced electron transfer）是指在激发状态下，被分析物质的最高占有轨道（HOMO）的电子向荧光核的HOMO 转移，阻止荧光探针的荧光核激发电子回到基态，使得荧光猝灭；（2）分子内电荷转 移（ICT,intramolecular charge transfer）是指在激发状态下，荧光核上的强吸电子或给电 子基团的共枕兀电子体系重新排布，此时其吸收和发射均发生红移或者蓝移；（3）荧 光共振能量转移（FRET,fluorescence resonance energy transfer）是指供体（Donor）的荧 光核与受体（Acceptor）荧光核的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团的距离 合适时，可表现出荧光能力有供体想受体转移的现象；（4）激基缔合物（excimer/exciplex）是两分子或原子在基态时无相互作用，当其中一分子收到激发后，与另一基态分子结合，形成动态激基缔合物，其吸收光谱和激发光谱发生变化。目前文献中报道的关于不同种类重金属离子的检测现总结如下。2.2.1 金属Ci?+荧光鉴别铜离子是一种人体必需的金属元素，但如果体内铜元素过多，会导致急性中毒，严重可导致昏迷、休克及死亡。因此对于铜元素的荧光探针的合成也具有现实意义。7万方数据陕西中医药大学2015届硕士学位论文Zhaochao Xu15刀等人合成出一种与可以形成激基缔合物的荧光探针用以检测 Cu2+,如图Scheme 11所示。研究结果表明，在水溶液中，加入其它不同金属离子的 情况下，均不能形成激基缔合物，说明该探针对于CM+具有良好的选择性。在乙睛溶 液中，随着铜离子浓度的增加，荧光强度逐渐增强，说明其灵敏度高。JianjunQil 等人设计研究出一种苯并嚷哇狭类化合物用于检测铜离子的荧光探针，如图Scheme 12所 示。在柠檬酸根的存在下，C/+可以转换成Cu1同时Cu+能够与荧光探针上的末端 块点生产有机金属化合物使得荧光猝灭dynamic excimerexcimerCu2*(1 equiv.)CHSCNScheme 1-1Cu(ll)NaAsc i r_ Cu(l).quantitativeFluorescenceNonfluorescenceScheme 1-22.2.2 金属Hg2+荧光鉴别汞在浓度很低时就会对生物体产生极强的毒性，会破坏人体的中枢神经系统以及 内分泌系统。因此合成出能够快速检测中药材汞元素及含量的荧光探针具有重要的研 8万方数据中药材DNA及立金属快检技术研究究价值。QiuJuanMa【59等研究合成出一种用于检测Hg?+的荧光探针，如图Scheme 13所 示。该探针是基于罗丹明香豆素形成共匏体系而设计的，对于汞离子的检测具有高 选择性和灵敏性。研究表明，当加入汞离子后，该荧光探针中的酰胺键断裂，使得探 针与金属离子的结合物在565 nm处有紫外吸收，当除去汞离子后，酰胺键重新连接，形成环状结构，说明该探针具有可逆性。Xing Ma网等人研究出一种含有一个类似于 葡萄糖的残糖基团的用于检测Hg2+的荧光探针。残糖集团的末端双键能够与Hg2+配 形成离子，使得残糖基团与荧光核水解脱离后转化。同时残糖基团还可以增加该探 针的水溶性，将Hg2+加入该探针的水溶液中，溶液前后颜色有明显变化。Scheme 1-32.2.3 金属C(F+荧光鉴别镉现被广泛应用于工业生产中，使得环境中的镉含量明显增加。镉在人体内堆积 可导致肾损害和骨质疾病，长期接触的话能增