过氧化氢酶(CAT)活性的测定.doc

过氧化氢酶（CAT）活性的测定：紫外吸收法

一、 目的与要求

过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。

二、原理

过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液的吸光度（A240）随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
三、材料、仪器设备及试剂

（一） 材料：小麦或其它叶片

（二）仪器设备：1. 研钵；2.紫外分光光度计；3. 离心机；4. 恒温水浴；
5. 容量瓶。

（三）试剂：

1. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液（pH7.8: 0.2mol/L Na2HP04 91.5 ml; 0.2mol/L NaH2P04 8.5 ml）；

2．0.1 mol/LH2O2 (30%的H2O2溶液5.68ml稀释至1000ml)

二、 实验步骤：

1、酶液提取 称取新鲜植物叶片或其它组织0.5g，置于研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨匀浆后，转入25ml 容量瓶中，并用缓冲液冲研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀，将容量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上清液在4000r/min下离心15min，上清液即为过氧化氢粗提液，5℃下保存备用。

2、测定 10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表1-1顺序加入试剂。

25℃预热后，逐管加入0.6ml0.1mol/l的H2O2,每加完1管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，260nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测完后，按式（1-1）计算酶活性。

表1-1 紫外吸收法测H2O2样品测定液配制表
管号
S1
S2
S0
空白
粗酶液 （ml）
0.4
0.4
0.4(失活酶液)
0.4（磷酸缓冲液）
PH7.8磷酸缓冲液（ml）
3.0
3.0
3.0
3.0
蒸馏水（ml）
2.0
2.0
2.0
2.0

3、结果计算 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（μ）。

过氧化氢酶活性（μ.g-1min-1）=ΔA240*Vt/(0.1*Vl*t*FW) （1-1）

式中 ΔA240 ： As0-(As1+As2)/2;
As0 ：加入失活酶液的对照管吸光值；
As1，As2 ： 样品管吸光值；
Vt ：粗酶提取液总体积（ml）；
Vl ：测定用粗酶提取液体积（ml）；
FW ： 样品鲜重（g）；
0.1 ： A240每下降0.1为1个酶活单位（μ）；
t ： 过氧化氢到最后一次读数时间（min）