DB43∕T 1959-2020 辣椒炭疽病菌检测技术规程(湖南省).pdf

湖南省地方标准DB43湖南省市场监督管理局发 布DB43/T 1 5 2020 9 92020-12-29发布2021-03-29实施辣椒炭疽病菌检测技术规程Technical Regulations for Detection of of L.Colletotrichum complexCapscium annuumICS 65.020CCS B 16DB43/T 19592020 I 目 次 前言 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 原理 1 5 仪器设备与试剂 2 5.1 仪器设备 2 5.2 主要试剂 2 6 采样 2 6.1 样品采集 2 6.2 样品贮运与存放 2 7 操作方法 2 7.1 样品 DNA 制备 3 7.2 检测 3 8 结果判定 4 9 样品保存与处理 4 附录 A（资料性） 辣椒炭疽病菌相关资料 5 附录 B（规范性） 辣椒炭疽病菌样本鉴定报告 7 DB43/T 19592020 II DB43/T 19592020 III 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由湖南省农业农村厅提出。 本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：湖南省植物保护研究所。 本文件主要起草人：谭新球、张鑫、满益龙、陈岳、郑立敏、张卓、欧阳超、刘思珍。 DB43/T 19592020 IV DB43/T 19592020 1 辣椒炭疽病菌检测技术规程 1 范围 本文件规定了辣椒炭疽病菌高效、快速检测和种类鉴定的样品制备、检测技术和操作程序。 本文件适用于土壤、辣椒种子、辣椒植株和果实中炭疽病菌的检测和种类鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 辣椒炭疽病菌属半知菌亚门、类腔菌纲、黑盘菌目、刺盘孢属真菌（Colletotrichum Complex）,目前我省已经报的辣椒炭疽菌有辣椒胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides） 、辣椒尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum） 、辣椒平头孢炭疽菌（Colletotrichum truncatum） 、辣椒红色炭疽菌（Colletotrichum capsici）和辣椒短孢炭疽菌（Colletotrichum brevisporum）等 5 个种，存在不同的地理分布特征。辣椒炭疽病主要危害辣椒的茎秆、叶片、果实，形成典型的病斑，严重影响辣椒的产量和品质。见附录 A。 4 原理 利用真菌高度保守的核糖体基因转录间隔区（Internal transcribed spacer, ITS） ，结合病原菌的单核苷酸重复序列（Simple sequence repeat, SSR）和真菌基因组中诱导坏死基因（Necrosis-inducing secreted gene，NIS）进行相应特异性扩增片段比较，确定辣椒炭疽病菌的种类和种内菌株的差异。 4.1 ITS 进化速率较编码区快，在真菌的种间存在着丰富的变异，而在种内不同菌株间却高度保守，可以为病原菌的分子检测提供靶序列。根据辣椒炭疽病菌 ITS 的特异序列，合成特异性引物，获得辣椒炭疽病菌特异性扩增片段，用于辣椒种子、茎秆、叶片和果实中炭疽病菌的检测。 4.2 SSR 在真菌基因中比例较高， 而且稳定性好， 基于辣椒炭疽病菌种类比较多且普遍存在复合侵染，ITS-PCR 鉴定不能区分不同种和相同种菌株间差异。根据辣椒胶孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）基因组，以 6 个碱基为重复单元，以 100-300 个核苷酸大小为靶标序列，设计合成 7对特异性引物，获得辣椒炭疽病菌的特异性扩增片段，用于辣椒种子、茎秆、叶片和果实等样品中炭疽病菌种类鉴定和种内菌株差异性的检测。 4.3 NIS 基因在真菌遗传中比较保守，但是不同菌株之间存在明显差异，为病原菌的分子检测提供靶DB43/T 19592020 2 序列。根据辣椒炭疽病菌 NIS 的特异序列，合成特异性引物，获得辣椒炭疽病菌特异性扩增片段，用于辣椒种子、茎秆、叶片和果实中炭疽病菌的检测和田间复合种群的检测。 5 仪器设备与试剂 5.1 仪器设备 PCR 检测仪、凝胶成像仪、台式离心机、土壤取样器、纯水仪、电泳仪、旋涡振荡器等。 5.2 主要试剂 苯酚/氯仿/异戊醇、乙醇、二甲基亚砜、氢氧化钠、脱脂奶粉、DNA marker、吐温 20、PCR 试剂盒等。 除特别说明以外，本文件所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 的规定。 6 采样 6.1 样品采集 6.1.1 土壤 田块 W 型 5 点取样，取 1-10cm 深度的 50 g 土壤样品。 6.1.2 辣椒种子 将辣椒种子混匀后称取 50 g。 6.1.3 辣椒茎秆和叶片 每块田 W 型选 5 个点， 取田间发病植株上部相对幼嫩的茎秆和叶片， 每点取 5 株植物的茎秆和叶片，混合后取样 20g。 6.1.4 辣椒果实 每块田 W 型选 5 个点，取田间发病辣椒果实，称取发病组织样本 20g。 6.2 样品贮运及存放 样品采集后，放入密闭的容器内，送实验室。将取样结果进行记录，记录表格见附录 B。处理的样品应保存在-20以下，避免反复冻融。 7 操作方法 7.1 样品 DNA 制备 7.1.1 土壤中 DNA 的提取 经 100 目过筛后的土壤加入少量无菌水（10g 土壤加入 5 mL 无菌水）后冷冻抽干 24-48h，然后加入少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至 1.5 mL 离心管中，每管加入 500L 0.4脱脂奶粉溶液，涡旋混匀。12000 rpm/min 离心 10 min。取上清加入等体积浓度为 20 g/mL 的DB43/T 19592020 3 蛋白酶 K 缓冲液，55水浴 2h。水浴结束后，加入 1/2 体积的 7.5 M NH4Ac 溶液，混匀。12000 rpm/min 离心 10 min。吸上清液加入 2 倍体积无水乙醇，-20沉淀 0.5h，12000 rpm/min 离心 10 min，去除上清液，70乙醇洗涤沉淀物，室温晾干。提取的 DNA 用 20l 含 RNA 酶的 TE 缓冲液溶解，-20保存备用。 土壤 DNA 也可用土壤 DNA 提取试剂盒提取。 7.1.2 种子、茎秆、叶片和果实中 DNA 的提取 分别将混匀后的辣椒种子、茎秆、叶片和果实液氮研磨成粉末，称取 0.1g 于 2 mL 管子中，加入800L CTAB 提取液，65水浴 15 min，期间不定期摇匀；加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25241） ，混匀后摇床轻摇 20 min； 12000 rpm/min 离心 10 min， 吸上清 500L， 加入 3 倍体积的无水乙醇， -20沉淀 0.5h，12000 rpm/min 离心 10 min，去除上清液，70乙醇洗涤沉淀物，室温晾干。提取的 DNA用 20L 含 RNA 酶的 TE 缓冲液溶解，-20保存备用。 7.2 检测 7.2.2 PCR 检测 7.2.2.1 引物设计与合成 根据真菌病害通用 ITS 序列，设计 ITS 特异性引物；参考辣椒胶孢炭疽病菌基因组，设计特异性的SSR 引物；根据真菌 NIS 基因序列，设计 NIS 引物。所有设计引物序列如下表，均由生物公司合成。 引物名称 正向引物序列（5-3） 反向引物序列（5-3） ITS TCCTCCGCTTATTGATATGC GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG SSR1 GCTAGCGAGTTGAACGCC CCCATCCATCCCTGTTGA SSR2 GGTTGTCGTACGTGCGTG TCTTTTGCTGCTCCCGTC SSR3 GGCTGGAGCTTGGTCTCA TCGTCAGGAACACAGCGA SSR4 CAGTGGGCACTCCCAATC CCCTCACACCGAGCTGAT SSR5 GGCAACTTCCATCCGGTA TTGAAGGCCATCTCTCCG SSR6 GAGCCATGGATGCTTTGG CTTTGCCCACTGCCACTT SSR7 CTCACCCGTTCCGTCATC GTCTCGTTTGGGTGGTGG NIS ATGCAGTTCCGCGCTTCCATCGCCGCC TTACTGGCTGCCGACGTAGTTCTCGCT 7.2.2.2 反应体系 辣椒炭疽病菌 PCR 检测反应条件为：反应体积为 25L，其中包括 10 PCR buffer 2.5L，10 mol/L 的引物对各 0.2L，MgCl2(5mM) 2.5L，dNTPs（10mM）2.0L，Taq Polymerase 1U，DMSO 0.5L，10梯度稀释的辣椒炭疽病菌基因组 DNA 作为阳性模板，阴性对照采用无菌水，另设一个不加任何模板的空白对照。 7.2.2.3 反应条件 PCR 扩增程序：94预变性 3 min；94变性 30 sec，60退火 30 sec，72延伸 30 sec，32 个循环；72延伸 7 min。 7.2.2.4 凝胶电泳 DB43/T 19592020 4 7.2.2.4.1 琼脂糖凝胶电泳 对于 ITS 和 NIS 引物扩增产物，采用 1琼脂糖电泳检测。将 10L PCR 产物用浓度为 1琼脂糖电泳分离（电压 120V，时间 20min） ，经溴化乙锭染色后于紫外灯下，拍照记录结果。 7.2.2.4.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 对于 SSR 引物扩增产物，采用 8聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。将 10 L PCR 产物用 8聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（电压 120V，时间 60 min） ，经 0.2 硝酸银染色后置于摇床上震荡约 10 分钟；然后用水漂洗 3 次，加入显色液并置于摇床上直至 DNA 条带出现且清晰可见，拍照记录结果。 8 结果判定 阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下： 如待测样品ITS扩增出600-650bp左右的条带， 则判定为该样品辣椒炭疽病菌PCR鉴定结果为阳性；如待测样品未扩增出 600-650bp 左右的条带，则判定为该样品辣椒炭疽病菌菌 PCR 鉴定结果为阴性。 NIS 扩增出 492-600bp 左右的条带，其中 492 bp 为辣椒胶孢炭疽病菌，512 bp 为辣椒尖孢炭疽病菌，其他不同炭疽病菌为不同大小的条带，可以判定辣椒炭疽病菌种类。 SSR 扩增出 80-300bp 左右的条带，根据出现带的大小和有无，可以判定同种炭疽病菌内部是否存在变异。 9 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对辣椒炭疽病菌 PCR 检测结果为阳性的样品应保存于-20冰箱中，以备复核。该样品保存期满后须经高压灭菌（121 15min）后方可处理。 DB43/T 19592020 5 附 录 A （资料性） 辣椒炭疽病菌相关资料 A.1 分布地区 辣椒炭疽病是辣椒生产上的世界性病害， 我国能够种植辣椒的产区均有发生和危害。 在高温高湿条件下，流行蔓延快，为害时间长，为害重，损失大。辣椒炭疽病发生后一般减产 2040,严重的减产达 50以上，严重影响辣椒的产量，品质和种植效益。 A.2 为害症状 辣椒炭疽病是辣椒生产上的主要病害，分布普遍且为害严重。叶片染病多发生在老熟叶片上，产生近圆形的褐色病斑，亦产生轮状排列的黑色小粒点，严重时可引致落叶（图 A.1） 。茎和果梗染病，出现不规则短条形凹陷的褐色病斑，干燥时表皮易破裂。果实染病，先出现湿润状、褐色椭圆形或不规则形病斑，稍凹陷，斑面出现明显环纹状的橙红色小粒点，后转变为黑色小点（图 A.2） 。天气潮湿时溢出淡粉红色的粒状粘稠状物。天气干燥时，病部干缩变薄成纸状且易破裂。 图 A.1 辣椒炭疽病叶片和茎秆危害状 图 A.2 辣椒炭疽病果实危害状 DB43/T 19592020 6 A.3 侵染与病害流行 炭疽病的发生流行与多种因素有关，主要包括品种、田间菌源量、气候条件及栽培管理措施等。病菌以分生孢子附于种子表面或以菌丝潜伏在种子内越冬， 播种带菌种子便能引起幼苗发病； 病菌还能以菌丝或分生孢子盘随病残体在土壤中越冬， 成为下一季发病的初侵染菌源。 越冬后长出的分生孢子通过风雨溅散、昆虫或淋水而传播。病菌发育温度范围为 12-33，高温高湿有利于此病发生。 DB43/T 19592020 7 附 录 B （规范性） 辣椒炭疽病菌样本鉴定报告 样品种类 采样时间 采样地点 样品数量 采样部位 样品来源 送检日期 送检人 送检单位 联系电话 检测鉴定方法： 检测鉴定结果： 备注： 鉴定人（签名） ： 审核人（签名） ： 鉴定单位盖章： 年 月 日 注：本单一式两份，检测单位和受检单位各一份。本检测结果只对送检样品负责。