DB43∕T 1966-2020 大型溞繁殖毒性试验技术规程(湖南省).pdf

湖南省地方标准DB43湖南省市场监督管理局发 布DB43/T 1 662020 92020-12-29发布2021-03-29实施大型溞繁殖毒性试验技术规程Guideline for Reproduction Test of Daphnia magna StrausICS 65.020CCS B 16DB43/T 19662020 I 目 次 前言 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 环境条件 1 5 仪器设备和器材 2 6 培养基 2 7 试验溶液 2 8 受试生物 2 9 试验方法 3 10 质量保证 4 附录 A（资料性） Elendt M4 培养液和 M7 培养基的制备 5 DB43/T 19662020 II DB43/T 19662020 III 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020 给出的规则起草。 本文件某些内容可能涉及专利。本文件发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由湖南省农业农村厅提出。 本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：湖南省植物保护研究所,长沙艾格里生物科技有限公司。 本文件主要起草人：陈昂、刘勇、张德咏、张战泓、罗杰、蒋桂芳、陈武瑛、熊浩、罗香文。 DB43/T 19662020 IV DB43/T 19662020 1 大型溞繁殖毒性试验技术规程 1 范围 本文件规定了大型溞繁殖试验的环境条件、 仪器和设备、 培养基、 试验方法、 质量保证与质量控制、数据处理等。 本文件适用于湖南省实验室内大型溞繁殖毒性试验。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 14942 食品容器、包装材料用聚碳酸酯成型卫生标准 GB/T 31270 化学农药环境安全评价试验准则 NY/T 1667 农药登记管理术语 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 亲溞 Parent Animals 试验开始时用于繁殖的雌溞。 3.2 幼溞 Offspring 试验期间亲溞所产的溞。 3.3 死亡 Mortality 溞体不能游动，或轻晃试验容器，15 s 内溞的附肢或后腹部也未见活动。 4 环境条件 4.1 光照 每天光照 16 h，光照强度不超过 1500 lx。 4.2 温度 试验的温度在 1822 范围内。对于同一个试验，温度变化不得超过 2 。 DB43/T 19662020 2 4.3 溶解氧 试验开始与试验期间，溶解氧浓度应大于 3 mg/L。 4.4 pH pH 在 69 的范围内。正常情况下，任何一个试验中 pH 值的变化不应大于 1.5 个单位。 4.5 硬度 硬度（以 CaCO3计）应大于 140 mg/L。 5 仪器设备和器材 试验容器和其它试验溶液接触的器皿应为全玻璃制品， 或由其它化学惰性材料制成。 试验容器通常为玻璃烧杯。需要的主要仪器为： a） 溶解氧测定仪； b） 适当的温度控制设备； c） pH 计； d） 水质硬度测定仪； e） 测定水中总有机碳（TOC）或化学需氧量（COD）的设备； f） 光照控制设备以及光度计等。 g） 色谱分析仪、质朴分析仪等 6 培养基 6.1 推荐 Elendt M4 和 M7 培养基（见附录 A） 。 6.2 Elendt M4 和 M7 培养基不能用于含有金属受试物的测试，对于含有金属的供试品，可选择替代培养基，如不含有 EDTA 的 ASTM 重组水。 7 试验溶液 7.1 不同浓度的试验溶液一般由储备液稀释而成。 储备液最好是将供试品加入到试验用水中配制而成。 7.2 若使用溶剂或分散剂助溶，其在培养基中的最终浓度应0.1 mg/L。 8 受试生物 8.1 受试生物为大型溞（Daphnia magna Straus） ，保持良好的培养条件，使大型溞的繁殖处于孤雌生殖状态，且试验结束时每只存活亲溞所产存活幼溞的平均值60 只。 8.2 试验开始时， 试验用溞应是出生小于 24 h 的非头胎溞。 试验用溞应来源于同一个健康的保种培养，即未表现任何受胁迫现象（如死亡率高，出现雄溞和冬卵，头胎延迟，体色异常等） 。日常培养条件（光照、温度、培养液、喂食单位体积的动物数量）应当和试验条件一致，如果试验时溞类培养基与日常使用的培养基不同，试验前最好设置驯养期，一般试验用溞应在试验条件下驯养 3 周（即一代）以避免新培养基对亲溞产生胁迫作用。 DB43/T 19662020 3 9 试验方法 9.1 暴露条件 9.1.1 试验周期 一般为 21 d。 9.1.2 试验负载 9.1.2.1 每个容器一只亲溞，容器中培养液体积为 50100 mL。 9.1.2.2 尽管允许合并各平行的溶液进行化学分析，有时为了分析测定供试品浓度的需要，需要增加溶液的体积。若所用体积大于 100 mL，需要增加溞的喂食量以确保有足够的食物。对于流水式试验，可分成 4 个平行，每组 10 只溞放在一个较大的试验容器中，应记录对于试验设计的任何变化。 9.1.3 曝气 试验期间不能曝气。 9.2 试验生物及喂食 9.2.1 半静态试验 每个供试物浓度处理组及对照组至少 10 只溞并分开培养，最好每天喂食，至少也应每周 3 次（即更换溶液时） 。 9.2.2 流水式试验 要求每一浓度 40 只溞，分成 4 个平行，每组 10 只。也可减少试验用溞，但至少 20 只，且应该以相同数量分成两个或多个平行。若有亲溞死亡，就不能计算试验结束时每只存活亲溞的繁殖量。在这种情况下繁殖量应该以试验开始时存在的每只亲溞所产存活幼溞总数表示。 9.2.3 如果使用替代测定的方法，如藻细胞数量法或光吸收法来计算喂食量，每个实验室都应单独建立碳含量和替代测定方法的指标之间的线形图。线形图至少每年校准一次。 9.2.4 推荐食物：小球藻（Chlorella sp.） 、羊角月牙藻（Pseudokirchneriella subcapitata）和栅藻（Desmodesmus subspicatus） 。喂食量以提供每只亲溞的有机碳数量为基础，应在 0.10.2 mg C/（溞d）范围内。喂食量在试验期间可保持不变，也可以在初期稍低，随亲溞的生长而逐渐增加，但始终应在推荐的范围内。应给大型溞喂食浓缩了的藻液，尽量避免过多的藻培养液浸入试验容器。浓缩藻液可通过离心获得，然后用蒸馏水、去离子水或溞培养液使其重新悬浮。 9.3 试验设计 9.3.1 预实验 按正式试验的条件，设置较大范围浓度系列的试验药液，每个试验浓度组设 2 个平行，对照组不设平行，以得到正式试验的浓度范围。 9.3.2 正实验 在预实验确定的浓度范围内按一定比例间距（极差应控制在 3.2 倍以内）设置至少 5 个浓度组，并DB43/T 19662020 4 设立空白对照组，如使用溶剂助溶还应设溶剂对照组。 9.3.3 限度试验 设置上限浓度 10 mg/L，浓度组和对照组均设 10 个平行。若供试物溶解度小于 10 mg/L，则采用最大溶解度作为上限浓度。 9.3.4 参比物质实验 应定期（至少每年一次）进行参比物质试验，参比物质为重铬酸钾。 9.4 培养基更换频率 半静态试验中，每周至少更换 3 次溶液，若供试品不稳定，应考虑增加更换频率，或使用流水式系统。转移亲溞时，原有溶液体积应尽可能最少。 9.5 幼溞 从头胎开始，应每天从试验容器中移出幼溞，以避免食物的消耗影响亲溞。对存活的幼溞、死亡的幼溞和死胎进行计数，并记录雄溞和冬卵出现的情况。 9.6 死亡率 每天记录亲溞的死亡数。 9.7 分析、测定频率 9.7.1 每周测定一次对照组和供试物最高浓度处理组的新、旧溶液的溶解氧浓度、温度、硬度和 pH。 9.7.2 试验期间应每周测定溶液中的供试物浓度。 9.7.3 半静态试验的供试物浓度应保持在配制浓度或初始浓度的20范围内，那么在更换溶液时，每周测定一次最高和最低浓度组的新、 旧溶液的浓度。 不在此范围内， 则必须分析所有新、 旧试验溶液。 9.7.4 流水式试验无需测定待更新试验溶液，应每天检查试验用水及贮备液的流速。 9.8 数据处理 9.8.1 在试验期间，若供试物浓度保持在配制浓度或初始浓度的20范围内，应以配制浓度或初始浓度计算结果。若偏离此范围，则以实测浓度计算结果。 9.8.2 通过对供试物处理组繁殖的幼溞总数量进行与空白对照组的数据进行统计分析，以此来评估供试物对大型溞繁殖试验的影响。选择合适的统计方法或相关统计学软件计算 EC及其 95置信限。 10 质量控制 10.1 试验开始时所用幼雌溞溞龄不能超过 24 h，且为非头胎溞。 10.2 为确保试验的有效性，对照组应符合以下要求： a） 试验结束时，亲溞的死亡率不能超过 20； b） 试验结束时，每只存活亲溞所产成活幼溞的平均值60 只。 DB43/T 19662020 5 附 录 A （资料性） Elendt M4 培养液和 M7 培养基的制备 A.1 Elendt M4 培养液和 M7 培养基的制备 使用去离子水、蒸馏水或反向渗透水分别制备各微量元素的贮备液，用贮备液制备贮备液，它含有的所有微量元素（混合液） ，见表 A.1。 表 A.1 微量元素配制表 贮备液 （单一物质） 加入到水中的量 （mg/L） 浓度 （与M4培养基的关系） 为制备混合的贮备液把贮备 液加入到水中的量（mg/L） M4 M7 H3BO3 5 7190 20 000 倍 1.0 0.25 MnCl2 4H2O 7 210 20 000 倍 1.0 0.25 LiCl H2O 6 120 20 000 倍 1.0 0.25 RbCl 1 420 20 000 倍 1.0 0.25 SrCl2 6H2O 3 040 20 000 倍 1.0 0.25 NaBr 320 20 000 倍 1.0 0.25 Na2MOO4 2H2O 1 260 20 000 倍 1.0 0.25 CuCl2 2H2O 335 20 000 倍 1.0 0.25 ZnCl2 260 20 000 倍 1.0 1.0 CoCl2 6H2O 200 20 000 倍 1.0 1.0 KI 65 20 000 倍 1.0 1.0 Na2SeO3 43.8 20 000 倍 1.0 1.0 NH4VO3 11.5 20 000 倍 1.0 1.0 Na2EDTA 2H2O 5 000 2 000 倍 FeSO4 7H2O 1 991 2 000 倍 Fe-EDTA 溶液 1 000 倍 20.0 5.0 注：Na2EDTA 和 FeSO4两者单独制备，倒在一起后立即灭菌。 A.2 常量营养元素和维生素 常量营养元素和维生素见表 A.2。 DB43/T 19662020 6 表 A.2 营养元素和维生素 加入到水中的量 （mg/L） 浓度 （与M4培养基的关系） 加入制备培养基中贮备液的量 （mg/L） M4 M7 贮备液 20倍 50 50 （微量元素混合液） 常量营养贮备液（单一物质） CaCl22H2O 293 800 1 000倍 1.0 1.0 MgSO47H2O 246 600 2 000倍 0.5 0.5 KCl 58 000 10 000倍 0.1 0.1 NaHCO3 64 800 1 000倍 1.0 1.0 Na2SiO39H2O 50 000 5 000倍 0.2 0.2 NaNO3 2 740 10 000倍 0.1 0.1 KH2PO4 1 430 10 000倍 0.1 0.1 K2HPO4 1 840 10 000倍 0.1 0.1 混合维生素贮备液 10 000倍 0.1 0.1 混合维生素贮备液是把三种维生素加到 1L 水中制成的，如表 A.3 所示。 表 A.3 混合维生素贮备液 加入到水中的量 （mg/L） 浓度 （与M4培养基的关系） 盐酸硫胺（维生素B1） 750 10 000倍 氰钴胺（维生素B12） 10 10 000倍 钙长石（维生素H） 7.5 10 000倍 注：混合维生素贮备液应以较小分装冷藏保存。应在使用之前把维生素加入到培养基中。