六α淀粉酶酶学性质测定II改.pptx

六、六、-淀粉酶酶学性质测定淀粉酶酶学性质测定IIII（米氏常数（米氏常数KmKm值的测定值的测定)1.1.目的意义目的意义 由由Leonor MichaelisLeonor Michaelis和和Maud MentenMaud Menten在在19131913年提出年提出的米氏方程（的米氏方程（Michaelis-Menten EquationMichaelis-Menten Equation）是酶学中表）是酶学中表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的、表示一个酶促示整个反应中底物浓度和反应速度关系的、表示一个酶促反应的起始速度反应的起始速度V V与底物浓度与底物浓度SS关系的方程。关系的方程。米氏方程形式如下所示：米氏方程形式如下所示：其中，VmaxVmax表示酶被底物饱和时的反应速度，KmKm值称为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度,即即V V=1/2=1/2V Vmaxmax时时,K Km=Sm=S。在酶促反应中，底物在低浓度情况下，反应相对于底物是一级反应（一级反应（first order reactionfirst order reaction）；而当底物浓度处于中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（混合级反应（mixed mixed order reactionorder reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应向零级反应（零级反应（zero order reactionzero order reaction）过渡；当底物浓度S逐渐增大时，速度V相对于S的曲线为一双曲线。下图为米氏方程的模拟作图：米氏常数的意义米氏常数的意义由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时,即即V V=1/2=1/2V Vmaxmax时时,K Km=S m=S。上式表示上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。浓度。因此因此,米氏常数的单位为米氏常数的单位为mol/Lmol/L(在本实验中单位为在本实验中单位为g/L)g/L)。不同的酶具有不同不同的酶具有不同KmKm值，它是酶的一个重要的特征物理常值，它是酶的一个重要的特征物理常数。数。KmKm值只是在固定的底物，一定的温度和值只是在固定的底物，一定的温度和pHpH条件下，一定的条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的KmKm值。值。KmKm值表示酶与底物之间的亲和程度：值表示酶与底物之间的亲和程度：KmKm值大表示亲和程度值大表示亲和程度小，酶的催化活性低小，酶的催化活性低;Km;Km值小表示亲和程度大值小表示亲和程度大,酶的催化酶的催化活性高。活性高。通过通过KmKm值的测定，可鉴定酶的各种底物，值的测定，可鉴定酶的各种底物，KmKm值最小者为酶值最小者为酶最佳底物，即天然底物。最佳底物，即天然底物。2.2.实验原理实验原理底物浓度对酶促反应的影响底物浓度对酶促反应的影响在酶浓度、pH、温度等条件不变的情况下研究底物浓度和反应速度的关系。如右图所示：在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。酶促反应中的米氏常数的测定和酶促反应中的米氏常数的测定和VmaxVmax的测定的测定有多种方法。比如固定反应中的酶浓度，然后测试有多种方法。比如固定反应中的酶浓度，然后测试几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得KmKm和和VmaxVmax值。但直接从起始速度对底物浓度的图中确定值。但直接从起始速度对底物浓度的图中确定KmKm或或VmaxVmax值是很困难的，因为曲线接近值是很困难的，因为曲线接近VmaxVmax时是个时是个渐进过程。因此，通常情况下，我们都是通过米氏渐进过程。因此，通常情况下，我们都是通过米氏方程的双倒数形式来测定，即方程的双倒数形式来测定，即Lineweaver-Burk Lineweaver-Burk plotplot，也可称为双倒数方程，也可称为双倒数方程(double-reciprocal(double-reciprocal plot)plot)：用用1/V 1/V 对对1/S1/S作图，即可得到一条直线，该直作图，即可得到一条直线，该直线在线在Y Y轴的截距即为轴的截距即为1/Vmax1/Vmax，在，在X X轴上的截距即为轴上的截距即为1/Km1/Km的绝对值，斜率为的绝对值，斜率为Km/VmaxKm/Vmax。如图所示：。如图所示：Km=-1/x3.3.仪器设备仪器设备3.1 试剂10mg/ml 可溶性淀粉 1500ml0.005%碘液 2000ml0.25M 醋酸溶液0.4M pH6.0醋酸缓冲液 3.2 3.2 器材器材15ml 15ml 大试管大试管2020支支1ml 1ml 移液管移液管2 2支支5ml 5ml 移液管移液管2 2支支10ml 10ml 移液管移液管2 2支支200ml 200ml 烧杯烧杯2 2个个100ml 100ml 烧杯烧杯2 2个个玻棒玻棒 1 1支支双蒸水双蒸水1 1瓶（瓶（50ml50ml）比色皿比色皿1 1套（套（4 4个）、玻璃皿个）、玻璃皿1 1套、洗瓶套、洗瓶1 1个个吸耳球吸耳球 1 1个个记号笔记号笔1 1支支试管架试管架2 2个个200l-1000l200l-1000l、20l-200l20l-200l、0.5l-0.5l-10l10l移液器各移液器各1 1支；支；小号、中号、大号枪头各小号、中号、大号枪头各1 1盒（需灭菌）盒（需灭菌）旋涡混合器旋涡混合器1 1套（置于每组桌上）套（置于每组桌上）4.4.实验方法实验方法取一定量的酶酶（稀释为10-6倍）；加入各种不同浓度的底物底物（如表所示）；在一定时间内测定产物产物的量（30min30min）；建立x，y轴，作图图，建立回归方程；在Y=0时，求其x x值值（即SS）KmKm；4.1 4.1 测定测定取取1212支试管，分别标记，按照下表操作。支试管，分别标记，按照下表操作。编号编号123456789底物浓度底物浓度S（mgmL-1）46810121416182010mg/ml淀粉溶液淀粉溶液（ml）0.40.60.81.01.21.41.61.82.0醋酸缓冲液（醋酸缓冲液（ml）2.62.42.22.01.81.61.41.21.0预热预热40 5min-淀粉酶淀粉酶（ml）1反应时间反应时间30min反应终止反应终止各管加入各管加入0.25M醋酸醋酸10ml显色反应显色反应取取1ml反应液加入预先加入试管中的反应液加入预先加入试管中的0.005%碘液中，振荡混匀碘液中，振荡混匀A(OD700nm)1/A1/S(mgml-1)注意：每组（不同底物浓注意：每组（不同底物浓度）都需要设置度）都需要设置D0D0为对照，计为对照，计算出算出U U值。值。4.2 4.2 数据处理数据处理各管在700nm测定OD700nm值（注意，比色皿务必洗净擦干）。由于光密度（OD700nm）与显色，显色与底物浓度成正比，反应时间均为30min。计算1/V，以1/V为纵坐标作图。由于测定所用单位为mgmL-1换算为Km单位gL-1。由1/V对1/S作图，求得回归方程，计算-淀粉酶催化可溶性淀粉溶解的米氏常数Km（当y=0时，求x值）。作图以1-5管数据来做。UV(U/30min)1/VS1/S