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生物化学实验教学大纲

湖北大学

生物化学实验
（课程代码）
实验教学大纲

（第2版）

生命科学学院
生化教研室
2010年7月

前 言

课程名称：生物化学 实验学时：64
适用专业：生物科学、生物技术、生物工程 课程性质：必修
一、 实验课程简介
生物化学实验课程是生命科学本科实验教学的一个重要组成部分，实验性质有基础性、综合性、设计（创新）性三层次，实验项目数共25个，按照学时要求完成必做及选做实验。在实验过程中要求学生自己动手，独立观察并完成实验报告，注重培养学生创新思维及能力。
二、课程目的
通过实验教学可以加强学生对生物化学基本知识和基本理论的理解，掌握现代生物科学及技术的实验原理及技能；同时，通过实验培养学生独立观察、思考和分析问题、解决问题和提出问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度，提高学生的科学素养以及敢于创新的开拓精神。
三、考核方式及成绩评定标准
生物化学实验课程考核采用笔试及操作能力二种方式；
期末成绩评定标准为：平时成绩60%；笔试10%；操作能力30% 。
四、实验指导书及主要参考书
1． 陈均辉等，《生物化学实验》科学出版社，2003年4月第三版
2． 蒋立科等，《生物化学实验设计及实践》高等教育出版社， 2007年10月 第1版
五、实验项目
实验项目一览表
序号
实验项目名称
实验类型
实验学时
必做/选做
实验一
蛋白质及氨基酸的呈色反应及甲醛滴定法测定氨基氮
验证性
3
必做
实验二
氨基酸的分离鉴定――纸层析法
验证性
3
必做
实验三
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白
验证性
3
必做
实验四
双缩脲法测定蛋白质浓度
验证性
3
必做
实验五
酪蛋白的制备及定量测定
综合性
4
必做
实验六
影响酶促反应的因素
验证性
3
必做
实验七
枯草杆菌蛋白酶活力的测定
验证性
3
必做
实验八
米氏常数的测定
验证性
3
选做
实验九
维生素C的定量测定
验证性
3
必做
实验十
核黄素的荧光光度定量测定
验证性
3
必做
实验十一
植物组织中蔗糖酶的提取及酶活力测定
综合性
5
选做
实验十二
紫外分光光度法测定核酸含量
验证性
3
选做
实验十三
腺苷三磷酸的测定（电泳法）
验证性
3
选做
实验十四
酵母核糖核酸的提取、鉴定及定量分析
综合性
5
必做
实验十五
糖的旋光性和变旋现象
验证性
3
必做
实验十六
还原糖的测定—3，5-二硝基水杨酸法
验证性
3
必做
实验十七
脂肪酸的β—氧化作用
验证性
3
必做
实验十八
大豆中粗脂肪含量测定和组分分析
综合性
5
选做
实验十九
卵磷脂的提取、鉴定及定量测定
综合性
5
必做
实验二十
阳离子交换树脂摄取氯化钠
验证性
3
必做
实验二十一
离子交换柱层析法分离氨基酸
综合性
4
必做
实验二十二
发酵过程中无机磷的利用
综合性
4
必做
实验二十三
乳酸脱氢酶活力测定
综合性
4
选做
实验二十四
凝胶过滤法测定蛋白质分子量
综合性
4
选做
实验二十五
脂蛋白的分离及鉴定—琼脂糖电泳
综合性
4
选做
合计

64

实验类型：演示性、验证性、综合性、设计性、其它

实验一 蛋白质及氨基酸呈色反应及甲醛滴定法测定氨基氮（3课时）
实验类型：验证性
实验目的：
学习几种常用的鉴定蛋白质及氨基酸的方法，掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。
实验内容：
1、茚三酮反应：
（1）取两支试管分别加入蛋白质和氨基酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，沸水浴加热1-2min，观察颜色由粉色变紫红再变蓝。
（2）在一小块滤纸上滴上一滴0.5%Gly溶液，风干后，再在原处滴上一滴0.1%的印三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红斑点的出现。
2、黄色反应：
向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。
管 号
1
2
3
4
5
6
7
材 料
（滴）
鸡蛋清
溶液4
大豆
提取液4
指甲
少许
头发
少许
0.5%
苯酚4
0.3%
色氨酸4
0.3%
酪氨酸4
浓硝酸（滴）
2
4
40
40
4
4
4
3、甲醛滴定
（1）标准Gly溶液的滴定。
（2）计算：
Gly氨基氮的回收率%=实际测得量∕加入理论值×100%
4、未知浓度Gly溶液的滴定
氨基氮（mg/ml）=（V未—V对）×NNaOH×14.008
实验要求：
要求仔细观察并记录实验现象，如颜色等变化，分析实验结果。

实验二 氨基酸的分离鉴定――纸层析法（3课时）
实验类型：验证性
实验目的：
学习分配层析的原理；掌握氨基酸纸层析法的操作技术要点；以及氨基酸的呈色反应原理。
实验内容：
1、平衡：将展层剂置于层析缸中进行平衡。
2、标记：取层析滤纸一张，在纸的一端距边缘2－3cm处用铅笔划一直线，在此直线上，每隔2－3cm做一记号（点样点）。
3、点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在标记的位置上，干后在原来点样位置再点一次（可用吹风机吹干，但要控制温度不能太高）。注意，每点的扩散直径不能超过3mm。
4、展层：用线将滤纸缝成筒状（用透明胶粘也可以），注意滤纸的两边不能接触。缝好后，将滤纸直立于层析缸中。（点样端在下，展层剂的液面需低于点样线）待溶剂上升15cm左右（约40min），取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，吹风机吹干。
5、显色：用喷雾器均匀喷上茚三酮显色液（要离开滤纸一定距离且要直立喷洒，显色液在滤纸上不能成柱状流下）；热风吹干，可见显色的各层析斑点。
6、计算：计用直尺量出原点到溶剂前沿及各层析点中心的距离，分别计算Rf值；并通过比较单种氨基酸样品及混合液中氨基酸的Rf值，指出相对应的氨基酸。

实验要求：
要求仔细观察并记录实验现象，计算并分析实验结果。

实验三 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白（3课时）
实验类型：验证性
实验目的：
学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，掌握电泳技术的原理。
实验内容：
1、浸泡：用木筷取醋酸纤维素薄膜，识别光泽面和非光泽面，并做记号，放在缓冲液中浸泡20 min。
2、点样：用木筷取出膜条（不能用手接触），夹在两层滤纸之间，轻轻按一下，吸干膜表面水分，膜无光泽面向上平铺在玻璃板上，点样器蘸取少许血清在距膜条一端2－3cm处点样。
3、电泳：将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，点样面朝下，点样端靠近负极，盖严电泳室，通电，调节电压为160V，电泳25min。
4、染色：用木筷取出膜条，浸泡于染色液中约10min。
5、漂洗：染色后，在浸泡于漂洗液中，漂洗2－3次，洗至无蛋白区底色脱净为止。
实验要求：
要求仔细观察并记录实验现象，计算并分析实验结果。

实验四 双缩脲法测定蛋白质浓度（3课时）
实验类型：验证性
实验目的：
学习并掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理及方法及标准曲线的绘制。
实验内容：
1、绘制标准曲线
管号
0
1
2
3
4
5
标准蛋白液/ml

0.2
0.4
0.6
0.8
1
蛋白质浓度（mg/ml）

2
4
6
8
10
蒸馏水/ml
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
双缩脲试剂/ml
4
4
4
4
4
4
充分混匀，室温（20-25℃）下放置30min
A540

2、样品测定
管号
0
1
样品液/ml

0.5
蒸馏水/ml
1
0.5
双缩脲试剂/ml
4
4
充分混匀，室温（20-25℃）下放置30min
A540

3、计算
样品中蛋白质含量（g/100ml）＝Y×N/V ×10－3×100
Y为从标准曲线上查得的蛋白质浓度（mg/ml），
N为稀释倍数，V为样品体积（ml）
实验要求：
定量实验要求正确使用移液管准确加量，计算并分析实验结果。

实验五 酪蛋白的制备及紫外定量分析（4课时）
实验类型：综合性
实验目的：
1、学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法；
2、掌握酪蛋白紫外分光光度法定量分析原理及方法
实验内容：
1、酪蛋白的制备
（1）制备酪蛋白粗制品：将一定量牛奶及pH4.7的醋酸缓冲液加热至40℃。调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000r/min）。取沉淀，得酪蛋白粗制品。
（2）多次水洗沉淀并离心15分钟（3000r/min），弃上清。
（3）有机溶剂洗沉淀：分别用一定量乙醇洗沉淀，布氏漏斗中抽滤。用乙醇重复洗一次后改用乙醚洗沉淀并抽干。风干，可得酪蛋白纯品。
（4）称重并计算含量和得率。
含量：酪蛋白g/100 ml 牛乳
得率：测得含量 /理论含量×100%
理论含量为3.5 g/100 ml 牛乳
2、酪蛋白的定量测定
采用紫外分光光度法，波长280nm，读取吸光度。以标准蛋白浓度为参照。
实验要求：
要求掌握提取蛋白质的原理和方法；学习紫外分光光度计的基本原理和使用方法，计算并分析实验结果。

实验六 影响酶促反应的因素（3课时）
实验类型：验证性
实验目的：
加深对酶的性质以及影响酶活因素的认识和理解
实验内容：
1、温度对酶活力的影响
取三支试管，编号后按下表加入试剂：
管 号
1
2
3
淀粉溶液（ml）
稀释唾液（ml）
煮沸过的稀释唾液
1.5
1.5
1.5
1
1
——
——
——
1
摇匀后，将1，3号两试管放入37℃恒温水浴中，2号试管放入冰水中。10分钟后取出（将2号管内液体分为两半），用碘化钾--碘溶液来检验1、2、3号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。2号管剩下的一半溶液放入37℃水浴中继续保温10min后，再用碘液实验
2、唾液淀粉酶的活化和抑制
管号
1
2
3
4
0.1%淀粉溶液（ml）
1.5
1.5
1.5
1.5
稀释唾液（ml）
0.5
0.5
0.5
0.5
1%硫酸铜溶液（ml）
0.5
——
——
——
1%氯化钠溶液（ml）
——
0.5
——
——
1%硫酸钠溶液（ml）
——
——
0.5
——
蒸馏水（ml）
——
——
——
0.5
37℃恒温水浴，保温10min
碘化钾——碘溶液（滴）
2~3
2~3
2~3
2~3
实验要求：
要求仔细观察并记录实验现象，计算并分析实验结果。

实验七 枯草杆菌蛋白酶活力的测定（3课时）
实验类型：验证性
实验目的：
学习测定蛋白酶活力的方法，掌握72型分光光度计的原理和使用方法
实验内容：
1、绘制标准曲线
2、酶活测定


‚
ƒ
Na2CO3溶液
酚试剂
30℃
放置15min
A680
1
1ml
——
——
5ml
1ml

2
——
1ml
——
5ml
1ml

3
——
——
1ml
5ml
1ml

3、计算酶活
1克枯草杆菌蛋白酶在30℃，pH7.5的条件下所具有的活力单位为：
（A样-A对).K.V/t.N
实验要求：
要求掌握测定蛋白酶活力的原理和方法；准确进行定量实验，计算并分析实验结果。

实验八 米氏常数的测定（3课时）
实验类型：验证性
实验目的：
了解底物浓度对酶促反应速度的影响，学习测定米氏常数的原理和方法
实验内容：
1、向6个小锥形瓶中分别加入5ml甲醛及1滴酚酞并用0.1mol/L 标准氢氧化钠溶液滴定至微粉红色
2、100ml酪蛋白溶液及胰蛋白溶液分别在37℃水浴10min，准确称量10ml酶液加到酪蛋白溶液中（同时计时），混匀后，取出10ml反应液作为零时样品。向反应液中加入甲醛、酚酞并用氢氧化钠滴定至终点，记下所用的氢氧化钠的ml数。在2、4、6、8min时分别取10ml消化样品。按上述方法操作，每个样品滴定终点颜色应一致，用增加的地定都对时间作图测定初速度。
3、配制不同浓度的酪蛋白溶液，测定不同底物浓度时的活力
4、用测得的实验结果，以1/V对1/[S]作图，求出V和Km的数值
实验要求：
要求掌握测定酶Km的原理和方法；画图、计算并分析实验结果。

实验九 维生素C的定量测定（3课时）
实验类型：验证性
实验目的：
掌握2，6-二氯酚靛酚法测定维生素C的原理和方法
实验内容：
1、不同样品用不同方法提取
（1）松针：用水将松针洗净，用滤纸吸去表面水分。称取1g，放入研钵中，加1%HCl溶液5ml一起研磨。放置片刻，将提取液转入50ml容量瓶中，如此反复2~3次。最后用1%HCl溶液稀释到刻度并混匀，静置10min，过滤，滤液备用。
（2）新鲜蔬菜和水果类：水洗净，用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后称取20.0g，加2%草酸100 ml置组织搅碎机中打成浆状。称取浆状物5.0g，倒入50ml容量瓶中以2%草酸溶液稀释至刻度。静置10min，过滤。滤液备用。
2、滴定
（1）标准液滴定。准确吸取维生素C溶液1.0ml（含0.1mg维生素C）置100ml锥形瓶中，加9ml1%草酸，用微量滴定管以0.1%2，6-二氯酚靛酚滴定滴定至淡红色，并保持15秒钟即为终点。由消耗染料体积计算出1 ml染料相当于多少mg维生素C。
（2）样液滴定。准确吸取滤液两份，每份10.0ml分别放入两个100ml锥形瓶中，滴定方法同前。
3、计算： m＝VT／m0×100
实验要求：
要求掌握滴定法测定维生素C的原理和方法；计算并分析实验结果。

实验十 核黄素的荧光光度定量测定
实验类型：验证性
实验目的：
1、把握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。
2、了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，把握其基本操作。
实验内容：
1、系列标准溶液的制备
2、激发光谱的绘制
设置λem＝540nm为发射波长，在250~500nm范围内扫描，记录荧光发射强度和激发波长的关系曲线，便得到激发光谱。从激发光谱图上可找出其最大激发波长λex。
3、标准溶液及样品的荧光测定
将激发波长固定在最大激发波长，荧光发射波长固定在最大荧光发射波优点。测量上述系列标准维生素B2溶液的荧光发射强度。数据记录于表2中。以溶液的荧光发射强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，制作标准曲线。
在同样条件下测定未知溶液的荧光强度，并由标准曲线确定未知试样中维生素B2的浓度，计算待测样品溶液中的维生素B2的含量。
4、数据记录及结果分析
1）激发光谱绘制过程中实验数据记录
2）标准溶液及待测溶液的浓度和荧光强度数据记录：
3）系列标准溶液浓度及荧光发射强度的标准曲线图：
4）则待测溶液的浓度的测量
实验要求：
要求掌握荧光分光光度法测定维生素B2的原理和方法；计算并分析实验结果。

实验十一 植物组织中蔗糖酶的活力测定（5课时）
实验类型：综合性
实验目的：
掌握植物组织中蔗糖酶的提取方法，以及蔗糖酶活力测定的原理
实验内容：
1、绘制标准曲线：取8支具塞试管按下表加入各试剂室温静置5min后，向每支试管中加7ml蒸馏水，混匀，在510nm下测光吸收值，以葡萄糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线
管号
1
2
3
4
5
6
7
8
葡萄糖（ml）
（4mmol/L）
0.00
0.02
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
水（ml）
1.00
0.98
0.95
0.90
0.85
0.80
0.75
0.70
Nelson试剂（ml）
1
1
1
1
1
1
1
1
混匀，盖上塞子，置于沸水浴中水浴20min后冷却至室温
砷钼酸试剂（ml）
1
1
1
1
1
1
1
1
2、蔗糖酶的提取及活力测定：
（1）提取蔗糖酶：称取绿豆芽3.672g于研钵中，以1ml/g加入乙酸缓冲液，在冰浴中用研钵研磨成糊状，以12000r/min离心10min，留取上清夜用于酶活力测定
（2）测定吸光值：取两支具塞试管，按下表加入各试剂室温静置5min后，向每管中加7ml蒸馏水，510nm下比色，测定光吸收值
管号
空白管
样品管
1ml/g乙酸缓冲液（ml）
0.8
0.8
0.5mmol/L蔗糖溶液（ml）
0.2
0.2
稀释5倍绿豆芽酶液（ml）
—
1
蒸馏水（ml）
1
—
混匀，室温下放置10min
Nelson试剂（ml）
1
1
混匀，盖上塞子，置于沸水浴中水浴20min后冷却至室温
砷钼酸试剂（ml）
1
1
3、酶活力计算：室温，PH4.5条件下，每分钟水解产生1umol葡萄糖所需的酶的量定义为酶的一个活力单位
酶活力=测得还原糖的含量（mg）×n×v×1000/W×t
上式中：n为稀释倍数
v为酶液总体积
w为样品重
t为反应时间10min
实验要求：
要求掌握提取酶蛋白提取及活力测定的原理和方法；准确进行定量实验，计算并分析实验结果。

实验十二 紫外分光光度法测定核酸的含量（3课时）
实验类型：验证性
实验目的：
1、
2、学习用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法
实验内容：
1、分析天平准确称取核酸样品500mg，少量水调成糊状，再加水稀释，氨水调节到pH7，定容到50ml
2、紫外光吸收值的测定
管号
样品管
对照管
核酸样品溶液（ml）
2
2
蒸馏水（ml）
2
——
沉淀剂溶液（ml）
——
2
混匀，在冰浴中放置30min后离心（3000r/min,10min)
分别取两管中的上清液0.5ml，蒸馏水定容至50ml，260nm处测定其光吸收值
3、计算
实验要求：
要求掌握紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法；计算并分析实验结果。

实验十三 腺苷三磷酸的测定（电泳法）
实验类型：验证性
实验目的：
掌握纸电泳法分析腺苷三磷酸的原理和方法。
实验内容：
1．样液的制备
用称量瓶称取样品(可用腺苷三磷酸粗品或药用结晶品)100．Omg，用3～4ml蒸馏水溶解，仔细倾入10ml容量瓶中，再加1～2ml蒸馏水洗称量瓶2次，一并倒入容量瓶，最后用蒸馏水稀释至刻度，混匀。此溶液每毫升含样品10mg。
2．点样
取3era×30era滤纸3条，距滤纸一端约7cm处，用铅笔轻轻划一基线(图24)。
用点样管吸取样液10tA<j)t，将样液轻轻点在滤纸基线上，用冷风吹干(三条滤纸作三个重复测定)。于另一同样大小的滤纸条上，按同样方法点标准腺苷三磷酸溶液，作标准试验。
3．电泳
电泳槽两端贮液槽内都注以pH4．8柠檬酸缓冲液。将上述滤纸条的两端用柠檬酸缓冲液浸湿后(注意：点样处勿浸入缓冲液中!)，将滤纸放在电泳槽中．点样端置负极，另一端在正极。盖好电泳槽盖子，等滤纸条完全被缓冲液渗湿后，接通电源，调节电压至400V，30min后切断电源，取出滤纸条，挂在架上，置50℃烘箱烘干，或用电吹风吹干。
将烘干的滤纸条置紫外灯上观察，并用铅笔将斑点划出。根据标准试验腺苷三磷酸斑点的位置，决定另三条滤纸上哪一个斑点是腺苷三磷酸。
4．洗脱
取4支清洁干燥的小试管，标以O、1、2、3号码。将三条滤纸上的腺苷三磷酸斑点剪下，再剪成宽约1mm的细条，分别放在1、2、3号试管内。另在无斑点处剪一和腺苷三磷酸斑点大小相仿的滤纸，亦剪成细条，放在0号管内，作空白试验。
向上述4支试管内各加5．0ml 0．01m01／L HCl溶液浸提滤纸条，将腺苷三磷酸洗脱浸提2h，浸提期间经常摇动试管。
5．测定
将试管内浸提液分别倒入4只石英比色杯①，以0号管的浸提液调零（A=0） 测定1、2、3管浸提液A260im~，计算样品中腺苷三磷酸的质量分数。
实验要求：
掌握纸电泳法分析腺苷三磷酸的原理及计算样品中腺苷三磷酸质量分数的方法。

实验十四 酵母核糖核酸的提取、鉴定及定量分析（5课时）
实验类型：综合性
实验目的：
了解核酸的组分，学习并掌握提取、鉴定及定量测定核糖核酸的方法
实验内容：
1、酵母核糖核酸的提取：
15g酵母悬浮于90ml 0.04mol/L氢氧化钠溶液中并研磨均匀，悬浮液移至锥形瓶沸水浴加热30min，冷却。悬浮液中缓慢加入30ml酸性乙醇溶液并搅拌。待核酸核糖完全沉淀，3000r/min离心3min。弃上清，沉淀用95%乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一次后抽滤，空气中干燥沉淀。
2、 核糖核酸组分的鉴定：
（1）水解液的制作：200g提取的核酸加入1.5mol/L硫酸溶液10ml，沸水浴中加热10min制成水解液进行组分鉴定
（2）嘌呤碱的鉴定：干净试管中加入水解液1ml，过量氨水及1ml 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀
（3）核糖的鉴定：干净试管中加入水解液1ml，三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml，沸水浴10min，观察溶液是否变为绿色
（4）磷酸的鉴定：干净试管中加入水解液1ml及定磷试剂1ml，水浴加热，观察溶液是否变成蓝色
3．酵母核糖核酸的组分定量测定
（1）RNA标准曲线的绘制
（2）样品液中RNA含量的测定：
取2支试管，一支加入样品液（实验十四中提取的沉淀用水溶解即得）2ml和苔黑酚试剂2ml，另一支试管加入蒸馏水2ml和苔黑酚试剂2ml（为对照管），混匀后，置沸水浴中显色15min，用分光光度计在波长640nm处测光吸收值，查标准曲线，计算RNA含量
实验要求：
要求掌握核酸提取鉴定以及分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法；计算并分析实验结果。

实验十五 糖的旋光性和变旋现象（3课时）
实验类型：验证性
实验目的：
1、了解糖的变旋现象，掌握利用糖的旋光性测定糖浓度的方法
2、学会使用旋光仪
实验内容：
1、标准曲线的绘制
2、样品液的测定
实验要求：
要求掌握糖的旋光鉴定以及测定糖浓度的原理和操作方法；计算并分析实验结果。

实验十六 还原糖的测定—3，5-二硝基水杨酸法（3课时）
实验类型：验证性
实验目的：
掌握3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖的基本原理，进一步学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用
实验内容：
1、绘制标准曲线：配制不同浓度葡萄糖标准液
2、还原糖的提取；
3g食用面粉于50ml蒸馏水中搅匀，50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。浸出液于4000r/min离心5min，沉淀用20ml蒸馏水洗一次，再离心。两次离心的上清液收集在100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液
3、 显色：
干净试管中加入样品液0.4ml，蒸馏水0.6ml，DNS0.8ml进行显色反应
4、比色：波长540nm
5. 定量：查标准曲线
实验要求：
要求掌握定量测定糖浓度的原理和操作方法；计算并分析实验结果。
实验十七 脂肪酸的β—氧化（3课时）
实验类型：验证性
实验目的：
了解脂肪酸的β—氧化作用，掌握从肝组织中测定丙酮的含量的滴定法。
实验内容：
1、肝糜制备：取5g猪肝研磨加0.9%NaCl配制10ml浆液
2、β—氧化和酮体生成反应

磷酸缓冲液
正丁酸
肝糜
43℃
保温1.5h
1
3ml
2ml
2ml
2
3ml
－
2ml
3、沉淀蛋白质
43℃保温
1.5h

15%三氯乙酸
正丁酸
静止15min过滤
1
3ml
－

2
3ml
2ml
‚
4、酮体测定：记录滴定样品及滴定对照所用的硫代硫酸钠溶液的ml数。
5、计算样品中丙酮的含量：

实验要求：
要求掌握测定丙酮的含量的滴定法，计算并分析实验结果。

实验十八 卵磷脂的提取、鉴定及定量测定
实验类型：综合性
实验目的：
学习掌握以乙醚作为溶剂提取生蛋黄中的卵磷脂的原理及方法。
实验内容：
卵磷脂是甘油磷脂的一种，由磷酸、脂肪酸、甘油和胆碱组成。卵磷脂可溶于乙醚、乙醇等溶剂，因而可以利用这些溶剂进行提取。卵磷脂的胆碱基在碱性条件下可以分解为三甲胺，三甲胺有特殊的鱼腥味，可以此鉴别。
1、卵磷脂的提取：取15g生鸡蛋黄于150mL三角锥瓶中，加入40mL乙醚，放入磁搅拌器，室温下搅拌提取15min。然后静置30min，上层液用带棉花塞的漏斗过滤，往残渣中再加入15mL乙醚，搅拌提取min。第二次提取液通过过滤后，及第一次提取液合并，于60℃热水浴中蒸去乙醚，将残留物质倒入烧杯中，再于真空干燥器中进行减压干燥30min，以除尽乙醚，约可得5g粗提取物。粗提取物进行离心10min后，下层为卵磷脂，约得2.5-2.8g。卵磷脂可以通过冷冻干燥得到无水的产物。
2、卵磷脂的鉴定：取以上提取物约0.1g，于试管内加入10%NaOH溶液2mL，水浴加热数分钟，嗅之是否有鱼醒味，以确定是否卵磷脂。
3.乳化作用：两支试管中各加入3～5mL水，一只加卵磷脂少许，溶解后滴加5滴花生油。另一只也滴入5滴花生油，加塞极力振荡试管，使花生油分散。观察比较两只试管内的乳化状态。
4、定量测定：将干净的离心试管和玻棒置于100mL烧杯中，烘干、冷却后称量。
5、称取在65～70℃时过滤的油样10g 左右，注入离心管，放入烘箱中加热至40℃取出。
6、用移液管向离心管中加水0.5mL，用玻棒猛烈搅拌1min。然后取出玻棒，在离心管边上刮净玻棒上的油，将离心管放入离心机中进行分离，直至吸水膨胀后析出的磷脂沉于离心管的底部。
7、先倾出上层清油，再将磷脂离心分离，再倾出上层清油。离心管中沉淀物用丙酮进行洗涤，离心分离，倾出丙酮液。如此用丙酮反复洗涤分离3～4次，直到所得丙酮无油迹为止。
8、把盛有沉淀物的离心管和玻棒放入盛有离心管的烧杯中，置105℃烘箱内烘至恒重。
油脂的磷脂含量按下式计算：

式中 ： W1 一 沉淀物重（g ）
W2一 油样重（g）
实验要求：
要求在卵磷脂的提取及鉴定中仔细观察并记录实验现象，定量计算并分析实验结果。

实验十九 大豆中粗脂肪含量测定和组分分析（5课时）
实验类型：综合性
实验目的：
1. 掌握索氏抽提法测定粗脂肪含量的原理和操作方法
2. 了解测定过程中误差的来源及修正方法
实验内容：
1、滤纸包样：将滤纸切成8cm×8cm，叠成一边不封口的纸包，用硬铅笔编写顺序号，按顺序排列在培养皿中。将盛有滤纸包的培养皿移入105℃烘箱中干燥2h，取出放入干燥器中，冷却至室温。按顺序将各滤纸包放入同一称量瓶中称重（记作a），称量时室内相对湿度必须低于70%
2、包装和干燥：在上述已称重的滤纸包中装入3g左右研细的大豆粉，封好包口，放入105℃的烘箱中干燥3h，移至干燥器中冷却至室温。按顺序号依次放入称量瓶中称重
3、抽提：将装有大豆粉的滤纸包用长镊子放入抽提筒中，注入一次虹吸量的1.67倍的无水乙醚，试样品包完全浸没在乙醚中。连接好抽提器各部分，接通冷凝水水流，在恒温水浴中进行抽提，调节水温在70—80℃之间，使冷凝而下滴的乙醚成连珠状（120—150滴/min或回流7次/h以上），抽提至抽取筒内的乙醚用滤纸点滴检查无油迹为止（约需6—12h）。抽提完毕后，用长镊子取出滤纸包，在通风处使乙醚挥发（抽提室温以12—25℃为宜）。提取瓶中的乙醚另行回收
4、称重：待乙醚挥发后，将滤纸包置于105℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重为止（记作c）
5、计算：
粗脂肪含量（%）=×100
上式中：a是称量瓶加滤纸包重（g）
b是称量瓶加滤纸包和烘干样重（g）
c是称量瓶加滤纸包和抽提后烘干残渣重（g）
实验要求：
要求掌握索氏抽提法测定粗脂肪含量的原理和操作方法，计算并分析实验结果。

实验二十 阳离子交换树脂摄取氯化钠（3课时）
实验类型：验证性
实验目的：
学习并掌握离子交换层析法的原理和基本操作技术
实验内容：
1、树脂处理、转型：水浸过夜→盐酸浸泡→氢氧化钠溶液浸泡→盐酸转型→水洗至中性待用
2、装柱：采用重力沉降法
3、加样：加入6ml 10g/L的氯化钠溶液
4、洗脱：收集40ml洗脱液
5、滴定：用0.1mol/L的标准氢氧化钠溶液滴定洗脱液
6、计算
实验要求：
学习并掌握离子交换层析法的原理和装柱、洗脱及滴定等基本操作技术。

实验二十一 离子交换柱层析法分离氨基酸（4课时）
实验类型：综合性
实验目的：
1. 学习掌握利用阳离子交换树脂柱层析法分离氨基酸的原理和操作方法
2. 掌握分光光度法测定氨基酸的原理及方法，以及洗脱曲线的绘制
实验内容：
1、层析柱的准备：将强酸型阳离子交换树脂用氢氧化钠处理成钠型后洗至中性装柱
2、平衡：用pH5.8的柠檬酸缓冲液平衡交换柱
3、加样：由柱上端加入0.5ml氨基酸混合液
4、洗脱：用柠檬酸缓冲液洗脱，共收集80ml左右的洗脱液
5、显色及测定：各管洗脱液中加入1ml茚三酮，沸水浴15min，冷却后加入1.5ml 50%乙醇溶液，放置10min后，以第二管为空白，测定A570，以光吸收值为纵坐标，洗脱体积为横坐标绘制洗脱曲线。
实验要求：
要求掌握利用阳离子交换树脂柱层析法分离氨基酸的原理和操作方法，以及洗脱曲线的绘制。

实验二十二 发酵过程中无机磷的利用及ATP的生成（4课时）
实验类型：综合性
实验目的：
1、掌握定磷法测定无机磷的原理和操作技术
2、了解发酵过程中无机磷的利用及ATP生成情况
实验内容：
1、标准曲线制定
2、酵母发酵：取酵母适量稀释后于37℃发酵，每隔15min取出0.5ml悬浮液，立即加入三氯乙酸混匀，得无蛋白滤液，分别得到3份滤液。
3、无机磷的测定
管号
发酵时间（min）
无蛋白滤液 （ml）
蒸馏水（ml）
钼酸铵-硫酸溶液（ml）
α-1，2，4-氨基萘酚磺酸溶液（ml）
37℃保温10min再冷却至室温

1
－
0.1
2.9
2.5
0.5

2
15
0.1
2.9
2.5
0.5

3
30
0.1
2.9
2.5
0.5

4
－
－
3.0
2.5
0.5

4. ATP生成鉴定：参考实验十二 腺苷三磷酸的测定（电泳法）
实验要求：
要求掌握定量测定无机磷浓度的原理和操作方法；计算并分析实验结果。

实验二十三 乳酸脱氢酶活力测定（4课时）
实验类型：综合性
实验目的：
1. 学习从猪肉中制备肌肉匀浆的操作方法，
2. 掌握测定猪肉提取液中LDH活力及比活力的方法及原理
实验内容：
1、制备肌肉匀浆：取瘦猪肉20g，按w/v=1/4加入40℃预冷的10mol/L pH 6.5磷酸钾盐缓冲液，用组织捣碎机捣碎，取匀浆液4℃冰箱过夜，过滤后的红色液体为组织提取液。
2、LDH活力测定：预先将丙酮酸溶液及氢氧化钠溶液放在25℃水浴中预热。取2支光径为1cm的石英比色杯，在1支比色杯中加入0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液3ml，放在紫外分光光度计中，在340nm处经光吸收调至零；另一支比色杯用于测定LDH活力，依次加入丙酮酸钠溶液2.9ml，氢氧化钠溶液0.1ml，立即计时，摇匀后，每隔0.5min测A340nm，连续测定3min，以A对时间作图，取反应最初线性部分，计算A340nm、/min的数值。
3、蛋白质含量测定：可采用考马斯亮蓝法
4、数据处理
（1）LDH活力单位（U）/ml提取液＝
（2）LDH比活力（U/mg）=
实验要求：
要求学习定量测定动物组织中LDH酶活的原理，酶活力及比活力计算方法，分析实验结果。

实验二十四 凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量（4课时）
实验类型：综合性
实验目的：
学习凝胶过滤层析法的工作原理和基本操作技术，以及用凝胶过滤法测定蛋白质分子量的方法。
实验内容：
1、凝胶溶胀：干凝胶加水于沸水浴5min,l冷却至室温。
2、装柱：首先检查柱是否垂直，装柱前将溶胀的凝胶减压抽气10min以除尽气泡。用3-5倍总床体积的洗脱液平衡。
3、柱的检验及测定外水体积：用蓝葡聚糖2000检验柱的均匀程度，在蓝葡聚糖全部流出后，用610nm波长测定各管的吸光值，其洗脱体积即为柱的外水体积。
4、标准曲线的制作：画出洗脱曲线，算出每一种蛋白质的Ve/Vo,然后以Ve/Vo对lgM作图。
5、未知样本的测定：取未知样本2-3mg，溶于0.4-0.5ml0.9%NaCl溶液中，用同样方法，测出其Ve,计算Ve/Vo，再在图上找出对应的lgM值，从而求出M。
实验要求：
要求学习利用凝胶过滤法测定蛋白质分子量的方法的原理和操作方法，以及洗脱曲线的绘制。

实验二十五 脂蛋白的分离及鉴定——琼脂糖电泳（4课时）
实验类型：综合性
实验目的：
掌握琼脂糖电泳分离及鉴定血浆脂蛋白的方法及原理
实验内容：
1、铺板及制作加样槽：将0.5%琼脂糖置沸水浴中加热溶解，冷却到45--50℃，按每50ml琼脂糖加1ml17%的清蛋白的比例，加入一定量的17%的清蛋白。取10ml含清蛋白的琼脂糖平铺在玻璃板上，用2个文具夹夹住样品槽模板两端，轻轻放入距玻璃板短边1.5cm处尚未凝固的琼脂糖内，并使梳齿下沿玻璃板0.5mm左右，不能触及玻璃板，室温放置1h，小心取出样品槽模板，在凝胶面上即形成加样槽。
2、电泳槽的准备：在电泳槽中倒入pH8.6的巴比妥电极缓冲液，并调节电泳槽的水平。
3、加样：用微量注射器取10ul血浆小心地加到样品槽中。
4、电泳：将加样后的凝胶板平放在电泳槽支架上，两端各放一块用缓冲液浸湿的几层滤纸“搭桥”，样品端及电泳仪负极连接，待样品扩散进入凝胶15min后，打开电源开关，调节所需电压，电泳时间1h左右，关闭电源。
5、固定染色及干燥：取出凝胶板，在固定液中浸泡30min，用蒸馏水冲洗数次，用滤纸吸去残留水分，在用吹风机热风吹干。将胶片放在油红O染色液中染色过夜，取出后在乙醇—水（5：3）中浸洗5min，置于玻璃板上室温风干。
6、鉴定：切下染色区带的凝胶，捣碎，加入4ml乙醇—水（5：3）洗脱，30min后，于550nm比色测定各溶液的光吸收值，空白对照在同一块凝胶板上切下一块及染色带同样大小的凝胶，以上述同样方法处理。求出各种脂蛋白的百分含量。
实验要求：
要求学习琼脂糖电泳分离及鉴定血浆脂蛋白的原理和操作方法。
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