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嗜水气单胞菌感染美洲鳗鲡的病理变化观察
嗜水气单胞菌感染美洲鳗鲡的病理变化观察

[摘要] 本研究利用嗜水气单胞菌攻毒感染美洲鳗鲡，采集鳗鲡肝、脾、肾、心, 观察鳗鲡经嗜水气单胞菌感染后各脏器发生的组织病理变化，从组织病理学角度研究嗜水气单胞菌对美洲鳗鲡的致病性。结果显示，经嗜水气单胞菌感染后鳗鲡各脏器组织细胞均出现不同程度的病变。心脏中心肌细胞空泡化，心肌纤维浑浊肿胀，颗粒变性，心肌横纹模糊不清。肝细胞脂肪变性，胞浆内充满空泡，部分肝细胞坏死，肝组织间有含铁血黄素沉着；脾脏组织疏松，淋巴细胞数量变少，红细胞大量分布在脾髓中，静脉管中充满大量红细胞，单核细胞和浆细胞；肾小球坏死裂解，结构消失，部分坏死细胞脱落至肾小囊腔中，集合管上皮细胞肿胀，颗粒变性，部分上皮细胞脱落进入管腔中。

关键词：人工感染 嗜水气单胞菌 美洲鳗鲡 组织病理变化

Histopathological changes of different organs of American eels (Anguilla rostrata) infected by Aeromonas hydrophila

Abstract :To study the pathogenicity and pathological changes of the infection of Aeromonas hydrophila to farmed American eels,The Aeromonas hydrophila were used to infect American eel and collected spleen，liver and kidney of the moribund eels .The results show that eel tissue organs are different degrees of pathological changes by Aeromonas hydrophila infection.The heart showed that the Cardiomyocytes became vacuolization and Myocardial fibers were cloudy swelling,and granular degeneration, myocardial stripes were blurred;the liver cell was full of vacuoles because of steatosis,some part of them were necrosis,Hemosiderin was came into being between the liver tissue;spleen lymphocytes reduced significantly ,a large number of erythrocyte appeared in red pulp,the vein contained a lot of erythrocyte and monocyte;the structure of renal disappeared because of necrosis,some necrosis cells shedding into renal cysts,
The epithelial cells were swell and particals in Collection tube, some epithelial cells shed into the lumen.
Key words:Anguilla rostrata Aeromonas hydrophila Artificial infection Pathological changes

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目录

引言 1
1材料及方法 2
1.1 供试鳗鲡 2
1.2 细菌来源 2
1.3 人工感染和脏器材料的采集 2
1.4 主要试剂的配制 2
1.5 包埋剂的配制 3
1.6 包埋块的制作 3
1.7 玻璃刀的制作 4
1.8 半薄切片的制作和染色观察 4
1.9 超薄切片的制作和染色观察 4
2 结果 5
2.1 鳗鲡的解剖病理变化 5
2.2 鳗鲡心脏的组织病理变化 5
2.3 鳗鲡肝脏的组织病理变化 5
2.4 鳗鲡脾脏的组织病理变化 5
2.5 鳗鲡肾脏的组织病理变化 5
3 讨论 6
4 结论 7
致谢语 7
参考文献 8
图版说明 10

引言

美洲鳗鲡（American eel, Anguilla rostrata）为辐鳍鱼纲鳗鲡目鳗鲡亚目鳗鲡科中的一种。有一个蛇形身体及一个尖锐细小的头部。背部为棕色，腹部为茶黄色。它的牙齿尖锐但没腹鳍。随着世界养鳗业的发展，近十年来我国的鳗鲡产值逐年增长，发展更加迅速,但在目前高密度的集约化养殖生产过程中，鳗鲡病害时有发生,研究发现因细菌性疾病造成的经济损失约占90%，经济损失以亿元计。如何有效地防治鳗鲡细菌性疾病，这是近年来鱼病研究者们极其关注的课题。而对于高密度养殖的鳗鲡而言,由嗜水气单胞菌引起的疾病常常呈现较高的发病率和较高的死亡率，严重制约了鳗鲡养殖业的健康发展。
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是养鱼池中的常见菌，可引起鳗鲡的赤鳍病[1]，鲤鱼和金鱼的竖鳞病[2]，鲢鳙鱼的打印病[3]，青鱼和草鱼的细菌性肠炎，鲟鱼，鲑鳟，革胡子鲶，斑点叉尾鮰，异育银鲫等鱼类的败血症[4-6]。其在侵入鱼内后，能产生多种毒力因子如：内毒素、外毒素、胞外酶 、S 层蛋白 、菌毛等[7,8]，引起鱼体的全身溶血性贫血和广泛的组织细胞变性、坏死，引发各脏器组织的损伤。近年来，许多研究者对嗜水气单胞菌感染不同鱼类的病理学变化进行了较为深入的研究，如鲫鱼感染嗜水气单胞菌后的脾、肾、肝均有不同程度的出血、溶血，并形成多量的黑素-巨噬细胞[9]；杂交鲟感染嗜水气单胞菌后肝、肾、脾等内脏器官组织发生循环障碍，微血管扩张，广泛出现充血、出血或溶血，实质细胞经变性发展到坏死，严重时出现弥散性坏死灶[10]；海南牛鼻鲼感染嗜水气单胞菌后脾表现为急性败血型，肝呈弥漫性坏死,组织结构被破坏，肾病变以肾小球严重肿大和肾小管上皮细胞坏死为主[11]，但有关于嗜水气单胞菌侵染鳗鲡后各脏器组织病理变化的研究较少。鉴于该菌对鳗鲡的危害性较大，有必要了解其致病后所引起的一系列病理变化。本试验拟通过嗜水气单胞菌感染美洲鳗鲡体内不同脏器中引起的病理变化进行观察研究，并及正常脏器进行比较，以了解该病原菌主要侵害的组织及病理变化过程 ,了解嗜水气单胞菌的致病机理，为鳗鲡嗜水气单胞菌病的诊断提供参考依据。
1 材料及方法

1.1 供试鳗鲡
20尾美洲鳗鲡购自集美大学海水养殖场，平均体重为15g。鳗鲡置于480L水族箱内，水温保持在23-26℃之间，水族箱保持充足氧气，每天投饵及换水各两次，投饵后3h换水40%，鳗鲡暂养一周后进行感染。病原菌分离自发病美洲鳗鲡肝脏。

1.2 细菌
用于试验的细菌分离于发病美洲鳗鲡的肝脏，Biolog 生化鉴定和16S rRNA基因鉴定均为嗜水气单胞菌。

1.3 人工感染和脏器材料的采集
20尾鳗鲡平均体重为15g均分为PBS和细胞注射组。用灭菌生理盐水将新培养的细菌稀释为1.0×108cfu/ml后于鳗鲡背部肌肉注射0.1ml。观察感染后死亡或濒死鳗鲡的体表症状，解剖后对内部脏器组织进行病理变化观察。采集鳗鲡的实质脏器（心、肝、肾和脾）并制备3mm×3mm×3mm大小的组织块。

1.4 主要试剂的配制
①　 PBS缓冲液：甲液0.2mol/L Na2HPO4•12H2O 35.82g加蒸馏水溶解，最后稀释至500mL；乙液NaH2PO4•2H2O 15.605g，稀释至500mL。取甲液36.0ml和乙液14.0ml混合配制磷酸盐溶液（PH为7.2）。
②　 Epon812树脂，DDSA，MNA，DMP-30
③　 染色剂 Pual 蓝；洋红；硼氢化钠
④　 50%丙酮溶液，70%丙酮溶液，80%丙酮溶液，90%丙酮溶液。
⑤　 2%醋酸双氧铀 ：0.2g醋酸双氧铀加50%乙醇溶解，最后稀释至10ml。
柠檬酸铅：0.663g硝酸铅+0.88g柠檬酸铅加蒸馏水溶解，最后稀释至15ml

1.5 包埋剂的配制
为了使包埋块质地柔软，容易进行修块，所以按照以下方案配制：
配制剂量 70mL
Epon812 35mL
DDSA 8mL
MNA 27mL
DMP-30 1.4mL

1.6 包埋块制作
实验项目 实验内容 所需时间
预固定 组织块（小于1mm）浸入2.5戊二醛 2h(室温)或
磷酸缓冲液 过夜(4oC)
漂洗 0.1mol/L PBS缓冲液漂洗3次，10 min/次 30min
后固定 1%锇酸缓冲液，室温下 10min
漂洗 0.1mol/L PBS缓冲液漂洗3次，10 min/次 30min
系列脱水 50%丙酮 10min
70%丙酮 10min
80%丙酮 10min
90%丙酮 2次，10min / 次 20min
100%丙酮 2次，15min/ 次 30min
浸透 丙酮 ：包埋剂
1 : 1 60min
1 : 2 60min
1 : 3 60min
纯包埋剂 60min

包埋 纯包埋剂 60min
聚合 Epon812 24-36h

1.7 玻璃刀的制作
将2.5cm*40cm硬质条形玻璃的光滑边沿朝上，放在制刀机操作台面上，将其平均划割成2.5cm正方形小块，逆时针旋转45度，摆放于划割器下方，并将金属托叉放在方块玻璃下方，通过推过制刀机左侧手轮卡住两个对角线，拉动划割器，右手顺时针转动断裂旋钮，取出玻璃刀。

1.8 半薄切片的染色和观察
制作好包埋块后，进行包埋块的修块，然后用切片机进行切片（600nm-4μm），最后进行切片的染色和观察。
修块：将包埋块修成金字塔形，顶面约0.5mm，形状为长方形或梯形。
切片：将修好的包埋块放到样品夹头孔中，固定后调整好组织块于刀刃的位置，刀面于组织面平行，选定切片厚度（500nm-2.0μm）。切片时，通过手摇方式摇动样品臂进行切片，随着手轮的多次转动，多片半薄切片便会漂浮在水面上，然后用铜环捞取放于载玻片上。
固定及染色观察：步骤如下：60oC烘干固定→Paul蓝-1min→洋红+0.25%硼氢化钠-1min→烘干→观察拍照。

1.9 超薄切片的染色和观察

切片：在切出第一片半薄切片的基础上，调整切片厚度（60nm）和切片速度，让切片机进入自动切片状态，样品臂上下摇动，得到的切片会在水槽液面形成连续的切片带，用铜网吸附颜色为银白色或金黄色的切片，最后将铜网放在滤纸上晾干后再放入样品盒保存。
染色：2%醋酸双氧铀-25min→漂洗→柠檬酸铅-25min→漂洗→晾干→观察拍照

2 结果

2.1 鳗鲡的解剖病理变化
鳗鲡感染6小时后未发现病变，仅少数注射部位有轻微红肿，呼吸频率变快，24h后又一条鳗鲡死亡，剖检时肝肾肿大，部分濒死鳗鲡注射部位溃烂，皮肤脱黏，鳃基部和腹部轻微发红，鳃丝腐烂、色浅或呈紫黑色。感染48h后鳗鲡全部死亡，注射部位严重溃烂，下颌充血腹部水肿，腹部存在腥臭味液体，实质器官不同程度出血。
2.2 鳗鲡心脏的组织病理变化
心肌纤维浑浊肿胀，颗粒变性，心肌横纹模糊不清（图1-A）。心肌纤维溶解断裂，有大量淋巴细胞浸润，部分心肌纤维发生纤维素样变性（图1-B）。心肌细胞空泡化（图4-C）。部分心肌纤维扭曲断裂，局部坏死溶解（图4-D）。
2.3 鳗鲡肝脏的组织病理变化
肝细胞脂肪变性，胞浆内充满空泡。部分肝细胞坏死，坏死区疏松，肝细胞核固缩，碎裂，消失（图2-A）；血管充血扩张，充盈红细胞。肝组织间有含铁血黄素沉着（图2-B）。

2.4 鳗鲡脾脏的组织病理变化

脾脏组织疏松，出现局部坏死灶，淋巴细胞数量变少（图3-A）；红细胞大量分布在脾髓中，红白髓难以分辨，脾小体结构不清楚；被膜结缔组织增厚出血；血管中充满大量红细胞，单核细胞和浆细胞（图3-B）。

2.5 鳗鲡肾脏的组织病理变化

血管充血、出血，纤维样变后深染，有的毛细血管坏死，肝组织间隙增宽，有较多的淋巴细胞浸润，造成组织疏松离散（图4-A）；肾小球坏死裂解，结构消失，部分坏死细胞脱落至肾小囊腔中；集合管上皮细胞肿胀，颗粒变性，部分上皮细胞脱落进入管腔中；肾小管崩解，未出现完整结构（图4-B）。

3 讨论
嗜水气单胞菌广泛存在生物界中 , 经常从人体、 鱼体、 两栖类以及各种的食物中分离到 , 会引起水产动物、 家畜和人的发病[12,13]。由嗜水气单胞菌感染引起的鱼体组织病理变化的研究有过许多报道[9-20]。嗜水气单胞菌可产生多种毒力因子,具有溶血性、细胞毒性、肠毒素毒性，因此在鳗鲡感染嗜水气单胞菌后，经过一定时间的侵染，该菌就会产生细胞毒素侵入脾、肝、肾等组织器官,引起实质细胞病变坏死。最终患病鳗鲡会因各脏器代谢功能障碍而死亡。
本研究通过人工感染嗜水气单胞菌发现鳗鲡体表会充血、出血,剖检后可观察到肠壁有出血现象 ,有的在肝、 肾、 脾等内脏器官也会有出血现象。这及嗜水气单胞菌感染鱼体引发的败血症状一致[1-4]。通过病变组织观察发现，脾脏出现局部坏死灶，淋巴细胞数量减少，脾受到一定损伤,导致鳗鲡免疫系统遭到破坏,免疫功能减弱或丧失,机体抵抗力下降[14-16];肝脏中肝细胞变性坏死，血管充血扩张，使肝功能下降，机体食欲减退或废绝,并影响鳗鲡对营养物质的消化和吸收,肝元储存、解毒、造血和免疫抗体的产生均受到影响;肾脏肾小管上皮细胞的大量坏死，肾小球裂解，肾受到损伤,无法调节体内水及电解质以及维持血液的酸碱平衡,代谢废物和毒物不能及时排出,造成泌尿排泄系统障碍;心脏心肌纤维扭曲断裂，排列紊乱，使心脏无法正常供血，运输氧及各种营养物质，造成循环系统障碍。最终机体因心、肝、肾、脾等重要组织器官功能衰竭而亡。
显微镜观察下，在心、肝、肾中均可发现一定数量的淋巴细胞浸润，说明机体可通过淋巴细胞的增殖和免疫反应，释放抗菌物质以提高对嗜水气单胞菌的免疫力。这及张伟妮等关于人工感染嗜水气单胞菌对日本鳗鲡非特异性免疫功能的影响的部分研究成果相同[16]。此外，本研究在肝脏中发现有较多含铁血黄素沉着，有许多学者在嗜水气单胞菌感染中也都观察到了含铁血黄素的过量沉着。Miyazkai等在暴发MAS的养殖鲫鱼中,发现肝、脾、肾中有含铁血黄素沉着[18]，申会刚等在鲫鱼在脾胜和肾脏中发现一种特殊形式的坏死灶,内含含铁血黄素[9]。推测含铁血黄素是由坏死崩解的巨噬细胞融合而成。
Ventura等对感染嗜水气单胞菌的斑点叉尾鮰的组织病理观察，发现炎症反应仅在消化道、皮肤和皮下肌肉中发现[19]。由于本研究未进行这些部位的相关研究，故无法及本研究进行比较，但欧洲鳗鲡感染该菌后也发现消化道的病理变化，故推测美洲鳗鲡也可能有相关病变。
4 结论

嗜水气单胞菌感染美洲鳗鲡后，其病理变化表现为：鳗鲡心脏心肌横纹模糊不清，间隙增宽，心肌纤维溶解断裂，心肌细胞空泡化；脾脏出现局部坏死灶，脾脏组织疏松，淋巴细胞减少，红髓充满红细胞；肾小球坏死、裂解，结构消失，集合管上皮细胞肿胀 , 颗粒变性，严重的坏死脱落至管腔。肝细胞脂肪变性，部分肝细胞坏死，坏死区疏松，肝细胞核固缩，碎裂，消失，血管扩张，充盈红细胞，有含铁血黄素沉着。

致谢语
在为期两个月实验期间，陈锦明老师激情澎湃的讲学和严谨细致的实验态度都深深吸引着我，让我更加用心的投入到实验当中，每当碰到难解疑惑的问题时，老师的耐心讲解和手把手教学都能让我豁然开朗。在整个论文写作期间的指导和修改凝聚了陈老师的辛劳，老师的多次指点也让我获益匪浅，在此谨向恩师表达深深的谢意！他严谨的治学态度和谦和的做人方式让我钦佩，他的博学及为人师表的品格为我树立了榜样，他朴实认真的科研态度将使我受益终身。
最后感谢所有在实验上和写作中帮助过我的同学们。我将会在将来的生活当中不断努力，争取更上一层楼。

参考文献

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图版说明

图1 嗜水气单胞菌感染鳗鲡后心脏后的病理变化
图1-A 箭头示心肌纤维浑浊肿胀，颗粒变性，心肌横纹模糊不清。
图1-B 箭头示心肌纤维溶解断裂，有大量淋巴细胞浸润，双箭头示心肌纤维发生纤维素样变性。
图1-C 箭头示心肌细胞空泡化变性。
图1-D 箭头示部分心肌纤维扭曲断裂，局部坏死溶解。

图2 嗜水气单胞菌感染鳗鲡后肝脏的病理变化
图2-A 短箭头示有含铁血黄素沉着，长箭头示血管充血扩张、出血。
图2-B 箭头示肝细胞脂肪变性，胞浆内充满空泡，核被挤向一侧。

图3 嗜水气单胞菌感染鳗鲡后脾脏的病理变化
图3-A 圆圈示脾组织疏松，淋巴细胞数量减少。
图3-B 长箭头示静脉管内充满红细胞，单核细胞和浆细胞，短箭头示脾髓充满红细胞，白髓和红髓难以辨认。

图4 嗜水气单胞菌感染鳗鲡后肾脏的病理变化
图4-A 长箭头示集合管上皮细胞坏死后脱落；双箭头示血管充血，纤维样变后深染；短箭头示肾组织疏松，有淋巴细胞浸润。
图4-B 长箭头示肾小球坏死裂解，部分坏死细胞脱落至肾小囊腔中，短箭头示组织间有坏死红细胞碎片