DB50∕T 1148-2021 白掌种苗组培快繁技术规程(重庆市).pdf

ICS 65.020.99CCS B 62DB50重庆市地方标准DB50/T 11482021白掌种苗组培快繁技术规程2021 - 11 - 01 发布2022 - 02 - 01 实施重庆市市场监督管理局发 布DB50/T 11482021I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由重庆市农业农村委员会提出并归口。本文件起草单位：重庆市农业科学院。本文件主要起草人员：杨小艳、谢树章、王忠伟、韩垚、林清、吴红、王虹。DB50/T 114820211白掌种苗组培快繁技术规程1范围本文件规定了白掌种苗组培快繁的设施设备、操作流程等技术要求。本文件适用于白掌种苗的生产。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 8321 农药合理使用准则GB 19489 实验室生物安全通用要求NY/T 496 肥料合理使用准则 通则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1白掌 Spathiphyllum floribundum又名白鹤芋、苞叶芋、银苞芋，为天南星科白鹤芋属多年生常绿草本花卉。3.2组培快繁 tissue culture and rapid propagation从植物体分离出符合需要的器官或组织材料，通过无菌操作，在人工控制条件下进行离体培养，在短时间内获得大量遗传性一致个体的方法。3.3外植体 explant从自然生长的活体植物上获取的用于建立植物组培快繁体系的起始材料。3.4组培苗 plantlet利用植物组织、器官或细胞等作为起始材料，通过植物组织培养方式生产获得的植株。4缩略语DB50/T XXXXXX2下列缩略语适用于本文件。6-BA：6-苄基腺嘌呤（6-benzylaminopurine）IBA：吲哚丁酸（3-indole butyric acid）MS：一种常用基本培养基（Murashige 和 Skoog（1962）NAA：萘乙酸（naphthyleneacetic acid）Tween-20：聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯（Polyoxyethy-lene(20)Sorbaitan Monolaurate）5设施设备5.1设施要求包括准备室、药品室、培养基配制室、灭菌室、洗涤室、更衣室、接种室、培养室、驯化室等，根据生产工艺流程（生产流水线）有序排布。接种室和培养室应防潮、隔热保温、保持清洁，定期进行环境消毒。周边环境应干燥、安静、通风透光、空气清新。5.2仪器设备要求包括高压灭菌器、紫外灯、臭氧发生器、电子天平、pH 计、冰箱、微波炉、超净工作台、微量移液器、接种器具（电热杀菌器）、石英玻璃珠、枪状镊子、手术刀柄刀片、切割碟子、温度计、光照培养箱、培养架（包括日光灯）、调速振荡器、组培瓶、试管、盛装器皿（烧杯、试剂瓶等）、计量器皿（量筒、容量瓶等）以及其他常用消耗品等。仪器设备应符合GB 19489的规定。6组培快繁操作流程6.1接种前准备6.1.1培养基配制和灭菌6.1.1.1培养基配制芽诱导培养基：MS+1 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA +30 g/L 蔗糖+7 g/L 琼脂，pH值为5.65.8。继代增殖培养基：MS+ 0.4 mg/L 6-BA +0.05 mg/L IBA +30 g/L 蔗糖+7 g/L 琼脂，pH值为5.65.8。生根培养基：1/2 MS+0.05 mg/L IBA+30 g/L 蔗糖+7g/L 琼脂，pH值为5.65.8。配制培养基用水应不低于GB/T 6682 规定的三级水。6.1.1.2培养基灭菌培养基配制完后，分装至组培瓶中。121高压灭菌15 min20 min，取出冷却备用。6.1.2超净工作台消毒超净工作台（或洁净无菌接种室）提前30 min 打开紫外灯，灭杀菌30 min 后关掉紫外灯，然后开机通风，打开接种用电热灭菌器，15 min20 min 后人员才可进入室内。用75%酒精擦洗超净工作台台面消毒。6.1.3接种人员准备DB50/T 114820213接种人员应在更衣室更换拖鞋、穿白大褂（或接种服），戴上帽子和口罩后进入接种室（或经过风淋室后进入接种室），操作前和操作中经常用75%酒精棉球擦手。6.2外植体接种6.2.1外植体的选择应选择长势健壮、叶色浓绿有光泽、花朵大、无病虫害的优良植株带侧芽的当年生茎段。6.2.2外植体的消毒灭菌处理将选好的白掌侧芽茎段去除叶片后，用自来水冲洗干净，切除在外暴露的表皮，用75%酒精浸泡消毒1 min，倒出酒精后，用无菌蒸馏水冲洗2 次，再用3%次氯酸钠溶液（现配现用、避光）加1滴2滴Tween-20 消毒15 min20 min，并不断摇动。将次氯酸钠溶液倒出，用无菌蒸馏水冲洗5 次6 次，用无菌滤纸吸干水分。6.2.3接种器械灭菌接种器械先用75%酒精擦拭，再放在酒精灯外焰上灼烤，时间10 s。若使用接种用电热灭菌器，接种器械先用75%酒精擦拭，待电热灭菌器温度升至250 300 ，再插入接种用电热灭菌器中进行灭菌，第一次灭菌3 min4 min，以后每次使用灭菌15 s。6.2.4外植体接种将侧芽茎段平放在无菌滤纸上，用解剖刀剥掉外层叶片后，切取顶端0.5 cm0.8 cm的芽组织，接种到芽诱导培养基中。接种时左手拿组培瓶，右手轻轻取下盖子，然后用镊子将材料送入瓶中，轻轻一压，使外植体与培养基紧密接触，并使外植体在瓶内均匀分布。接种完毕立即盖上瓶盖并做好标记，注明材料名称、接种日期、培养基类型、接种人等事项。6.3培养6.3.1芽诱导外植体接种到芽诱导培养基后，将组培瓶整齐、均匀摆放在培养架上，温度25 ，光照强度2000lx3000 lx，光照12 h，黑暗12 h，诱导时间为40 d60 d。培养期间定期观察材料生长情况，并作好记载，如发现污染，应及时将污染瓶移出培养室，待高温灭菌后清洗或丢弃。6.3.2继代增殖快繁6.3.2.1提取母瓶应仔细检查，剔除污染母瓶。6.3.2.2取苗先打开组培瓶盖，瓶口不应斜向外，将取出的白掌丛生苗放于无菌的碟子上分苗。6.3.2.3切苗接种用解剖刀将白掌丛生苗切割成单株小苗或小团块，每个小团块3 株4 株小芽苗，将小苗或小团块接种到继代增殖培养基中，宜接种6 株8 株（团）/瓶。接种完毕后做好标记，注明材料名称、接种DB50/T XXXXXX4日期、培养基类型等事项。培养室温度为25 ，光照强度 2000 lx3000 lx，光照12 h，黑暗12 h，30 d 继代一次。6.3.3生根壮苗从继代增殖瓶苗中提取母瓶， 取苗放置于无菌的碟子上， 分苗切取生长健壮、 叶色正常、 叶片舒展、适于生根的幼苗接种到生根培养基中，宜接种10 株/瓶。接种完毕后做好标记，注明材料名称、接种日期、培养基类型等事项。光照强度 2000 lx3000 lx，光照12 h，黑暗12 h，30 d 后检查幼苗基部新根生长情况。其它操作要求参照6.3.2。6.4组培苗炼苗与移栽管理6.4.1组培苗移栽要求生根培养30 d 后，株高2.5 cm5.0 cm；茎干粗壮，不徒长；叶数3 片5 片，叶色翠绿，幼苗基部长出3 条以上、长1 cm3 cm 的新根，根系粗壮有活力。6.4.2炼苗将生根后的瓶苗移出培养室放入驯化室松盖炼苗2 d 以上，炼苗时温度为20 28 ，空气湿度为60%80%，光照强度为3000 lx5000 lx，保持环境洁净。6.4.3移栽基质准备用粗细度0 mm10 mm 泥炭加水搅拌预湿，相对含水量为55%60%。6.4.4移栽用镊子轻轻取出组培幼苗并洗净其根部培养基， 用0.2% 多菌灵+0.1% 生根粉溶液浸泡2 min5 min后，种植至装有基质的50 孔穴盘（长宽28.5 cm54 cm，孔径3 cm3 cm）中，再用0.2%多菌灵+0.1%生根粉溶液浇透基质。6.4.5移栽管理用薄膜和遮阳率75%的遮阳网盖膜保湿遮光， 空气湿度控制在75%85%； 14 d 后撤掉薄膜和遮阳网，不应强光直晒，保持基质湿润，养护温度为25 28 ；当小苗有新根和新叶长出时开始施肥。选用肥料应符合NY/T 496的规定，病虫害防治选用农药应符合GB/T 8321的规定。6.5种苗出圃当种苗株高5 cm8 cm，苗健壮挺拔，形态完整，叶数5 片10 片，叶色浓绿有光泽，根系成团时可出圃。