模式植物拟南芥TDNA插入突变体的PCR鉴定.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,十三 模式植物拟南芥,T-DNA,插入突变体的,PCR,鉴定,1,一、实验目的：,1.,学习用,PCR,方法检测生物遗传差异；,2.,了解植物,T-DNA,插入突变体的鉴定原理。,2,二、实验原理,1.Ti,质粒和,T-DNA,Ti,质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的,DNA,区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该,DNA,区段能自发转移，插入植物染色体,DNA,中，,Ti,质粒上的这一段能转移的,DNA,被叫做,T-DNA,。人们根据这一现象，将,Ti,质粒进行改造，将感兴趣的基因放进,T-DNA,区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。,2.T-DNA,插入基因内部导致基因突变,T-DNA,插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果,T-DNA,插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌,Ti,质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。,3,3.用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体,农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。,PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三个引物LP、RP和BP，其中LP和RP是植物基因组上T-DNA插入,位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。经过PCR，,在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带）,；,在杂合突变体，LP和RP能扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小带）；,在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小的产物（小带）,。,因此，利用以上三种引物做PCR，根据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。,4,左引物,LP,：,TCATCCACCATGGAAGAAAAG,右引物,RP,：,TTGGATACGATGCGAGTAACC,中间引物,LB:TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG,用,LP+RP,产生大带：,1107bp,用,LB+RP,产生小带：,560-860bp,5,三、实验步骤,实验材料：拟南芥,T-DNA,插入突变体分离群体,30,个株号的植株。,实验方法：（每人做,1,个株号的检测）,6,(,一,),拟南芥基因组,DNA,提取,7,1.,原理,分离动物、植物、微生物,DNA,是进行遗传操作（基因组,DNA,序列分析、遗传标记分析、基因克隆、基因定位）的第一个步骤。不同的研究目的对,DNA,的纯度和产量要求不同。,如：构建基因文库及用于限制性片断长度多态,(RFLP),等对纯度要求高；,用于,PCR,分析的,DNA,则应不含干扰,PCR,反应的污染物；,用于遗传标记分析的,DNA,，纯度要求低但产量则要高。,8,一个好的分离程序应符合三个标准：,所得,DNA,的纯度满足下游操作要求；,所得,DNA,应完整；,所得,DNA,量足够。,9,DNA,在化学上是稳定的，但它在物理上是易碎的，高分子质量的,DNA,长而弯曲，即具有极微弱的侧向稳定性，易受到最柔和的流体剪切力的伤害，由吸液、振荡、搅拌所致的水流能剪切断,DNA,双链。,提取动物、植物、微生物基因组的,DNA,所面临的问题不尽相同，在这个实验中学习植物总,DNA,提取与鉴定。,10,本实验采用,CTAB,法。,CTAB,的主要作用是破膜。,CTAB,属阳离子表面活性剂，能溶解膜蛋白与脂类，也可解聚核蛋白。在高离子强度的溶液里，,CTAB,与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但是不能沉淀核酸。因此，,CTAB,可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括,E.coli,的某些株）中制备纯化,DNA,。,酚,/,氯仿,/,异戊醇的作用是去除核酸制品中的蛋白质，并有利于水相与有机相的分开，而且可以消除泡沫。,异丙醇或乙醇的作用是脱去,DNA,周围水分子，使,DNA,失水而聚合沉淀。,11,2,、药品,CTAB,提取液（,1000 ml,）组成：,20 g CTAB,100 ml 1 M Tris-HCl pH 8.0,40 ml 0.5 M EDTA pH 8.0,81.8 g NaCl,0.2%(V/V)-,巯基乙醇,注：先将除巯基乙醇之外的药品配好，高压蒸汽灭菌后加入巯基乙醇,酚,/,氯仿,/,异戊醇：,25,：,24,：,1,氯仿,/,异戊醇：,24,：,1,TE,缓冲液：,Tris-HCl(pH 8.0)10 mmol/L,，,EDTA 1 mmol/L,3 M NaAc,（,pH 5.2,）,12,3.DNA,提取步骤,用液氮将,100 mg,幼嫩叶片研磨成细粉，置于,1.5 ml,离心管中，加入预热至,65,的,600,l,的,2CTAB,提取液，轻摇混匀。,65,水浴,1 h,，其间轻摇混匀。,12000 rpm,离心,15 min,，弃沉淀，取上清转移至另一,1.5 ml,离心管中。,向上清液加入等体积的氯仿,/,异戊醇（,24,：,1,），轻轻混匀,10 min,，然后,12000 rpm,离心,15 min,，再转移上清入新管。,向上清液中加等体积的冷异丙醇，小心混匀。,-20,放置,30 min,，,12000 rpm,离心,10,min,，弃上清。,用,70%,乙醇洗涤沉淀一次，,12000 rpm,稍离心，弃上清。,将沉淀在超净工作台上吹干，或空气中晾干。加,50,l,TE(pH 8.0),放,4,缓慢溶解。,电泳检测,DNA,的浓度和质量。,13,注意事项,1,研磨后应迅速加入提取液，因为提取液中含,EDTA,，能够螯合,Mg,2+,等二价阳离子，防止破碎细胞中的,DNA,酶降解,DNA,。,2,提取过程中，避免剧烈震荡，以免对,DNA,造成不必要的机械损伤。,3.,干燥,DNA,时，要注意过干或过湿都不利于,DNA,的溶解。,14,（二）,PCR,反应,15,步骤,1.按如下方法调制PCR反应液，因每管加样量少，可几人一组预混除模板,DNA,之外的成分。分装后各人再加入自己的模板,DNA,。,PCR,管上注意写明株号和引物类型：,第一管：第二管：,10 xTaq buffer 2.5ul 10 xTaq buffer 2.5ul,MgCl,2,2 ul MgCl,2,2 ul,某株号模板DNA 2 ul 某株号模板DNA 2 ul,引物LP 1 ul 引物RP 1 ul,引物RP 1 ul 引物BP 1ul,dNTP 1 ul dNTP 1 ul,Taq酶 0.2 ul,Taq酶 0.2 ul,H,2,O 15.3 ul H,2,O 15.3 ul,总共 25 ul 总共 25 ul,2.PCR程序：94变性5min；94变性1min,50复性1min,72 延伸2min，共30个循环；72最终延伸10min;10保持。,3.PCR结束以后，将样品拿出，检查管子上的株号是否清晰，,放-20 保存，等待下次实验，电泳,检查结果,。,16,（三,)PCR,结果的电泳检查,17,步骤,用,1XTAE,或,TBE,电泳缓冲液配制,1,琼脂糖胶；,在,15 uL,PCR,产物,中加,3uL,上样缓冲液,(6x),，,15uL,基因组,DNA,中,加,3uL,上样缓冲液,(6x),，于,1%,琼脂糖胶上电泳,稳压,100,（,5,/cm,）；,电泳结束，溴化乙锭溶液染色,20,分钟（如果你的电泳凝胶中不含溴化乙锭）；,在紫外灯下或用凝胶成像仪观察、拍照。,18,PCR,产物电泳结果实例，,纯合的野生型只有大带，,纯合的插入突变型只有小带，,杂合的插入突变型有大小,2,个带,Marker WT T,19,基因组,DNA,提取结果实例：,左边泳道为分子量,Marker,20,