资源描述
专题5 DNA和蛋白质技术
【课题目标】
本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质，理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。
【课题重点与难点】
课题重点：DNA的粗提取和鉴定方法。
课题难点：DNA的粗提取和鉴定方法。
【知识要点】
1. DNA的物理化学性质，尤其是DNA的溶解性；
2. 2.二苯胺法鉴定DNA的方法和原理。
[学习导航]
DNA和蛋白质技术，包括DNA的提取、蛋白质的提取、DNA片段的扩增等，是开展分子生物学研究的基本技术。本专题将从基础入手，学习DNA的粗提取、PCR技术和血红蛋白的提纯。学习这些技术，不仅能够帮助学生初步了解分子生物学的基本实验方法，而且能够巩固必修课中学习的有关DNA和蛋白质的理论知识。
本专题的3个课题相对独立，没有严格的先后顺序。课题1的操作难度不高，学生比较容易获得结果。课题2的操作难度也不高，但PCR技术的原理是难点，学生要充分利用教材的图文资料，并且在教师的引导下进行实验操作。课题3的操作难度比较大，所以学生一定要在教师的精心指导下完成操作。
课题1 DNA的粗提取与鉴定
[导学诱思]
1．提取DNA的方法
提取生物大分子的基本思路是 。对于DNA的粗提取而言，就是要利用 、 等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
1）DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的 中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使 充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。
图5—1是DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线，请根据曲线图，
思考：
①在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？
②如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？
此外，DNA不溶于 溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。
2）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解 ，但是对 没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温，而DNA在 以上才会变性。洗涤剂能够瓦解 ，但对DNA没有影响。
3）DNA的鉴定 在 条件下，DNA遇 会被染成 色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
2．实验设计
1）实验材料的选取 凡是含有 的生物材料都可以考虑，但是使用 的生物组织，成功的可能性更大。在下面的生物材料中选取适合的实验材料：
鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基的大肠杆菌
思考：
哺乳动物的红细胞的特点？
2）破碎细胞，获取含DNA的滤液 动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的 ，同时用 搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用 溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的 和 ，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
思考：
①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
③如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响?
④此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？
3）去除滤液中的杂质 阅读课本的三个方案，
思考：
为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？
方案二与方案三的原理有什么不同？
4）DNA的析出与鉴定 将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积 、冷却的 ，静置 ，溶液中会出现 ，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒 搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。
取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为 的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的
。混合均匀后，将试管置于 中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变 。
3．操作提示
以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g ，防止 。
加入洗涤剂后，动作要 、 ，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要 ，以免 ，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
二苯胺试剂要 ，否则会影响鉴定的效果。
4．结果分析与评价
[疑难点拨]
1． DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：
当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低；当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。
2． 制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入柠檬酸钠的原因
制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入抗凝剂——柠檬酸钠，防止血液凝固。其原理是柠檬酸钠能与血浆中Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液便不会凝固，因为鸡血红细胞，白细胞都有细胞核，DNA主要存在于细胞核中，所以在离心或静置沉淀后，要弃出上层清液——血浆。
3．提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。
4．在DNA的析出的步骤中用到玻璃棒搅拌时，注意动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
5．盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。
[典例解析]
本实验中有三次过滤：
⑴过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液
⑵过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液
⑶过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液
以上三次过滤分别为了获得（ ）
A含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液
B含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA的滤液
C含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、纱布上的DNA
D含较纯的DNA滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液
答案：A
解析:用蒸馏水稀释鸡血细胞液，使血细胞的细胞膜、核膜破裂，释放出核物质，此时过滤只能得到含DNA和其他物质如蛋白质的滤液，这种滤液必须经过实验中其他步骤得相继处理，方能得到较纯的DNA。DNA在0.13mol/LNaCl溶液中溶解度最低，成丝状粘稠物，可经过滤留在纱布上。
【课本问题答案和提示】
（一）旁栏思考题
1．为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。
2．加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
3．如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
4．此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？
答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。
5．为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？
答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
6．方案二与方案三的原理有什么不同？
答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。
（二）练习
1．答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。
2．答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。
[课堂演练]
一、选择题（10个）
1.在研究DNA的基因样本前，采集来的血样需要蛋白水解酶处理，然后用有机溶剂除去蛋白质。用蛋白水解酶处理血样的目的是（ D ）
A.除去血浆中的蛋白质 B.除去染色体上的蛋白质 C.除去血细胞表面的蛋白质
D.除去血细胞中的所有的蛋白质，使DNA释放，便于进一步提纯
2．与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是（ C ）
A.操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度
B.在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整
C.加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出
D.当丝状粘稠物不再增加时，此时NaCl的浓度相当于0.14mol/L
3．洗涤剂能够瓦解（ B ），但对DNA没有影响。
A.细胞壁 B.细胞膜 C.细胞核 D.细胞质
4．在沸水浴的条件下，DNA遇（ D ）会被染成蓝色。
A.斐林试剂 B.苏丹Ⅲ染液 C.双缩脲试剂 D.二苯胺
5．在DNA提取过程中，最好使用塑料试管和烧杯，目的是（ B ）
A.不易破碎 B.减少提取过程中DNA的损失 C.增加DNA的含量 D.容易洗刷
6．下列操作中，对DNA的提取量影响最小的是（ B ）
A.使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，放出DNA等核物质
B.搅拌时，要使用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌
C.在“析出DNA粘稠物”时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增加
D.在用酒精沉淀DNA时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却
E在DNA的溶解和再溶解时，要充分搅拌
7．DNA的粗提取中，将与滤液体积相等的、冷却的（ D ），静置2—3min，溶液中会出现白色丝状物。
A.0．9%的NaCl B.0.14mol/L的NaCl溶液 C.质量分数15%的HCl D.体积分数为95%的酒精溶液
8.以血液为实验材料时，需要向血液中加入（ C ），防止血液凝固。
A.醋酸钠 B.龙胆紫 C.柠檬酸钠 D.醋酸洋红
9.在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（ C ）
A.加快溶解DNA的速度 B.加快溶解杂质的速度 C.减少DNA的溶解度，加快DNA析出 D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出
10.去除滤液中的杂质时，直接在滤液中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的（ C ）分解蛋白质。
A.胃蛋白酶 B.胰蛋白酶 C.木瓜蛋白酶 D.肠肽酶
二、非选择题（3个）
1．提取鸡血中DNA时，要除去血液中的上清液，这是因为什么？
答案：因为上清液是血浆，不含有血细胞，DNA存在于沉郁试管底部的鸡血细胞的细胞核中，所以提取鸡血中的DNA时，要除去血液中的上清液。
2．填写本实验完成下列实验操作时所用试剂。
⑴提取鸡血细胞中核物质
⑵溶解核内DNA：
⑶析出2mol/LNaCl溶液中的DNA
⑷DNA粘稠物的再溶解
⑸提取杂质较少的DNA白色乳状丝状物
⑹DNA的鉴定
答案：⑴蒸馏水⑵2mol/LNaCl溶液⑶蒸馏水⑷2mol/LNaCl溶液⑸冷却的95%的酒精⑹二苯胺
3.关于DNA粗提取的实验材料的选择，也经过了多次实验效果的比较，最终选择鸡血做实验材料的原因是什么？请回答下列问题：
⑴鸡血细胞中红细胞 ，家鸡属于鸟类，新陈代谢旺盛，因而血液中 细胞树木较多，可以提供丰富的 。
⑵实验前由老师制备血细胞液供同学们做实验材料，而不用鸡全血，主要原因是
。
⑶生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，若他们按实验要求完成实验步骤后，结果是 ，这是因为这些动物和人一样，成熟的红细胞中 ，但若改用动物肝脏做实验材料，实验能顺利进行。这是因为 。
⑷若选用动物肝脏做实验材料，在提取之前，最好增加 程序，使组织细胞更易分离。
答案：⑴含细胞核；红；DNA ⑵鸡血细胞液中DNA相对含量⑶很难提取到DNA；无细胞核；肝细胞有细胞核⑷研磨
【知识拓展】
1.二苯胺鉴定DNA的化学原理
DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈现蓝色(溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。
2.研磨液中几种药品的作用
Tris/HCl:提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态（Tris为三羟甲基氨基甲烷）。
EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。
SDS（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与DNA分离。
【教学反思】
课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段
【课题目标】
本课题通过尝试PCR（DNA多聚酶链式反应）技术的基本操作，使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法，理解PCR的原理，讨论PCR的应用。
【课题重点与难点】
课题重点：PCR的原理和PCR的基本操作。
课题难点：PCR的原理。
[导学诱思]
1．PCR原理
填写下列表格
参与的组分
在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
合成子链的原料
DNA聚合酶
引物
DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为 ，而磷酸基团的末端称为 。DNA聚合酶不能 开始合成DNA，而只能 ，因此，DNA复制需要引物。DNA的合成方向总是 。
在DNA的复制过程中，复制的前提是 。在体外可通过控制 来实现。在 的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为 。PCR利用了DNA的 原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。由于PCR过程的温度高，导致DNA聚合酶失活，后来 的DNA聚合酶的发现和应用，大大增加了PCR的效率。
PCR反应需要在一定的缓冲溶液中提供： ， ，
， ，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
2．PCR的反应过程
PCR一般要经历 循环，每次循环可以分为 、 和 三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由 延伸而成的DNA单链会与 结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能
，使这段固定长度的序列成指数扩增。
3．实验操作
在实验室中，做PCR通常使用 ，它是一种薄壁塑料管。具体操作时，用微量移液器，按PCR反应体系的配方在 中依次加入各组分，，再参照下表的设置设计好PCR仪的循环程序即可。
4．操作提示
为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的 、 、 以及蒸馏水等在使用前必须进行 。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在
储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。在微量离心管中添加反应成分时，移液管上的枪头要 。
[疑难点拨]
1.PCR技术简介
PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛的应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。
2．细胞内参与DNA复制的各种组成成分及其作用
①解旋酶：打开DNA双链 ②DNA母链：提供DNA复制的模板 ③4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 ④DNA聚合酶：催化合成DNA子链 ⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸（引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸）
3．DNA的合成方向
DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为3，端，而磷酸基团的末端称为5，端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3，端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3，端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5，端向3，端延伸。
4．PCR的反应过程
PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性（当温度上升到90oC以上时，双链DNA解聚为单链）、复性（温度下降到50oC左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合）和延伸（温度上升到72oC左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链）三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异的复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列成指数扩增。
5．PCR技术与DNA的复制
PCR反应是通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR反应的实质就是DNA复制，所以有关PCR反应的题目与DNA复制的原理相同，计算方法也大体相同。例如：PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段。（230）
[典例解析]]
一个由15N标记的DNA分子，放在没有标记的环境中培养，利用PCR循环5次后标记的DNA分子总数的（ ）
A 1/10 B 1/5 C 1/16 D1/25
答案：C
解析：一个DNA分子利用PCR技术循环5次后产生的DNA分子数目为2n。而DNA的复制是半保留复制，其特点是：新形成的DNA双链，一条是来自亲代DNA分子的母链，另一条是新形成的子链。这样最初由15N标记的DNA分子复制后，其标记的两条链就分别进入两个子代DNA分子中，这样两个子代DNA分子被标记了。以后均是在没有标记的环境中培养，不论经过多少次复制，最初标记的两条链始终存在于两个DNA分子中，这样经过n次循环后，标记的DNA分子中2/2n,即1/2n-1。
【课本问题答案和提示】
练习
1.提示：绘图可参考教科书中图5-9。PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段（2n=230=1 073 741 824)。
2.提示：PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验，感兴趣的学生可以参考《分子克隆实验指南》（见本专题参考书目），书中有详尽的论述。
【课堂演练】
一．选择题（10个）
1．DNA分子复制时，解旋的两条链中（ C ）
A仅一条作为复制模板
B两条链作为模板并复制出两个不同的DNA分子
C两条链作为模板并复制出两个相同的DNA分子
D两条链作为模板，各自合成一条子链，然后两条母链重新结合为原来的双螺旋分子，两条新链结合成一个全新的DNA分子
2.下列关于DNA复制过程的正确顺序是（ D ）
①互补碱基对之间氢键断裂②互补碱基对之间形成氢键③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对⑤子链与母链盘旋成双螺旋状结构
A①③④②⑤ B①④②⑤③ C①③⑤④② D③①④②⑤
3.下列各项过程中，遵循“碱基互补配对原则”的有（ A ）
①DNA复制②RNA复制③转录④翻译⑤逆转录
A①②③④⑤ B①②③④ C①②③⑤ D①③④⑤
4.实验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是（ D ）
①酶②游离的脱氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦适宜的温度⑧适宜的酸碱度
A①②③④⑤⑥ B②③④⑤⑥⑦ C②③④⑤⑦⑧ D①②③④⑦⑧
5.利用PCR技术，把一个双链DNA分子当作第一代，经过3次循环，在第四代DNA分子中，有几条第一代脱氧核苷酸的长链？（ A ）
A 2 B 4 C 8 D 16，
6.关于DNA分子的叙述中，正确的是（ C ）
A .DNA的两条链是极性相同，同向平行 B.DNA的两条链是极性相同，反向平行
C.DNA的两条链中极性不同，反向平行的 D.DNA的两条链是极性不同，同向平行
7.假设PCR反应中，只有一个DNA的片段作为模板，请计算在30次循环后，反应物中大约有多少这样的DNA片段（ B ）
A 215 B 230 C 260 D 231
8.DNA的合成方向总是（ C ）延伸。
A从DNA分子的左端向右端 B从DNA分子的右端向左端
C从子链的5，端向3，端 D从子链的3，端向5，端
9.要使PCR反应在体外的条件下顺利地进行，需要严格的控制（ C ）
A 氧气的浓度 B酸碱度 C温度 D 大气的湿度
10.DNA分子经PCR反应循环一次后，新合成的那条子链的脱氧核苷酸的序列应与（ ）
A模板母链相同 B非模板母链相同 C两条模板母链相同 D两条模板母链都不相同
二．非选择题（2个）
1．PCR技术是把某一DNA片段在实验条件下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用这种技术能快速而特异的扩增任何要求的目的基因或者DNA分子片段，“人类基因组计划”的研究中常用到这种技术。请结合有关知识，回答有关此技术的一些问题：
⑴PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，依据的原理是：
⑵在实验条件下，DNA分子进行扩增，除了所要扩增的DNA片段处，还需要 、和 、 等条件。
⑶某DNA片段有160个碱基，其中有腺嘌呤35个，若让该DNA分子扩增三次（即复制三次）至少需要腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸的数目分别是 和 个。
答案：⑴DNA分子具有双螺旋结构和DNA分子中碱基的互补配对
⑵四种脱氧核苷酸、能量、酶 ⑶245、315
2．将大肠杆菌置于含15N的培养基上培养。这样，后代大肠杆菌细胞中的DNA双链均被15N标记。然后将被15N标记的大肠杆菌作为亲代转到普通培养基中，繁殖两代。亲代、第一代、第二代大肠杆菌DNA的状况如图所示。
⑴第一代大肠杆菌DNA贮存的遗传信息与亲代大肠杆菌DNA贮存的遗传信息完全相同的原因是 。
⑵如果将第二代大肠杆菌的DNA分子总量作为整体1，其中，带有15N的第二代大肠杆菌DNA分子约占总量的 %。
⑶如果将第二代大肠杆菌的DNA含量作为整体1，其中含15N标记的第二代大肠杆菌的DNA含量（脱氧核苷酸单链）约占总量的 %
答案：⑴它们均是以亲代15N标记的DNA双链的每条链为模板，通过碱基互补配对原则合成的⑵50 ⑶25
【参考资料】
1.琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围的关系
凝胶浓度要依据DNA分子的大小来确定。编码双歧杆菌16srRNA的DNA片段大小约为1 500个核苷酸的长度，因此根据表4-1选用1％（1 g/100 mL，下同）的凝胶浓度。
表4-1琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围的关系
琼脂糖凝胶浓度(%)
线型DNA分子的分离范围(千碱基对，kb)
0.3
5～60
0.6
1～20
0.7
0.8～10
0.9
0.5～7
1.2
0.9～6
1.5
0.2～3
12.0
0.1～2
2.核酸电泳缓冲液
核酸电泳缓冲液有三种，分别是Tris—硼酸(TBE)、Tris—乙酸(TAE)和Tris—磷酸(TPE)。在上述三种缓冲液中：TBE与TPE缓冲液容量高，对DNA的分离效果好，但TPE液中含磷酸盐的浓度偏高，容易使DNA沉淀。TAE液的缓冲容量低，价格较便宜。本实验选用的是TBE缓冲液。缓冲液中的EDTA可螯合正价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR产物被降解。
10倍浓缩的TBE缓冲液配方如下。
Tris 108 g EDTA 9.3 g 硼酸 55 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH为8.0～8.2备用，使用时需稀释10倍。
3.核酸电泳的指示剂与染色剂
核酸电泳常用的指示剂是溴酚蓝，溴酚蓝在碱性条件下呈蓝紫色。指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液。载样缓冲液的作用是：能够增加样品密度，确保DNA均匀沉入加样孔内；能够在电泳中形成肉眼可见的蓝紫色指示带，从而帮助预测核酸电泳的速度和位置；能够使样品呈现蓝紫色，使加样操作更方便。
核酸电泳后，需要染色才能在紫外线下观察到带型。最常用的染色方法是溴化乙锭染色法。溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，有剧毒，因此操作时要非常小心。EB可嵌入DNA双链的碱基对之间，在紫外线激发下，能发出红色荧光。染色的方法有两种。一种是在凝胶电泳液中加入EB，使其终浓度为0.5 μg/mL；一种是在电泳后，将凝胶浸入0.5 μg/mL的EB溶液中，染色10～15 min。当凝胶染色过深时，可以将凝胶放入蒸馏水中浸泡30 min后再观察。
4.PCR的常见问题
PCR实验很容易出现假阳性或假阴性的结果。出现假阴性结果的常见原因有：Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统的建立欠妥当；循环次数不够；等等。当实验中出现假阴性的情况时，应首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA聚合酶，并增加5～10次循环。为了防止假阴性结果的出现，在选用Taq DNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。同时，在提取DNA模板时，应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度的要求不高，但也不允许有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件以及特异性的高低，很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况，尤其需要保证引物的3′ 端与靶基因互补。
PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增，因此模板DNA的污染是PCR假阳性结果的主要原因。此外，样品中存在靶基因的同源序列也可能造成假阳性结果。为了避免因污染而造成的假阳性结果，PCR操作时要注意做到：隔离操作区，分装试剂，简化操作程序，使用一次性吸头等
【教学反思】
课题3 血红蛋白的提取和分离
【课题目标】
本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。
【课题重点与难点】
课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。
课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
【导学诱思】
1．凝胶色谱法
凝胶色谱法也称做 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由 构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质 进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ；而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
2．缓冲溶液
缓冲溶液的作用是 。缓冲溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是 ，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。
3．电泳
电泳是指 。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。电泳利用了待分离样品中各分子 以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。
两种常用的电泳方法是 和 ，在测定蛋白质分子量时通常使用 。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 以及 等因素。
4．蛋白质的提取和分离
蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、 、 和 。
5．样品处理
血液由 和 组成，其中红细胞最多。红细胞具有
的特点。红细胞中有一种非常重要的蛋白质 ，其作用是
，血红蛋白有 个肽链组成，包括 ，其中每条肽链环绕一个 ，磁基团可携带 。血红蛋白因含有 呈现红色。
红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是 ，采集的血样要及时采用 分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层暗红色的 倒入烧杯，再加入 ，缓慢搅拌 ，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至 ，表明红细胞已洗涤干净。
血红蛋白的释放 在 和 作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。
分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的 ，第2层为白色薄层固体，是 ，第3层是红色透明液体，这是 ，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
透析 取1mL的血红蛋白溶液装入 中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的 中，透析12h。透析可以去除样品中 的杂质，或用于更换样品的 。
6．凝胶色谱操作
第一步要制作 ，第二步要 ，因为 ，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有 存在。因为气泡会 ，降低分离效果。第三步是
。
【疑难点拨】
1．凝胶色谱法分离蛋白质的原理
凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动，相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流
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