园艺植物育种学诱变育种.ppt

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,第十二章 诱变育种mutation breeding,孙 胜,2009-6,山西农业大学-园艺植物育种学,1,概念,诱变育种,：用各种物理的或化学的手段，,人工诱发有机体产生遗传物质的变异,，并经过人工选择、鉴定，培育所创造新品种的育种途径。也叫,突变育种,或,引变育种,。,特点：,突破,原有基因、基因库,限制,用各种物理、化学和生物因素或复合因素,诱发基因突变,丰富种质资源以,选育新品种,2,发展简史,诱变育种起始于,20世纪20年代末,。,最早发现,x射线,和,化学药剂,可提高基因突变频率。,20世纪50年代，辐射育种技术兴起,，并在园艺植物育种方面得到有效利用。,据FAO/IAEA统计资料，通过诱变育种获得的果树新品种数量在近二十年内急剧增长。,到1993年时，总计育成各种果树品种41个,（不包括我国的），其中苹果9个，欧洲甜樱桃8个，欧洲酸樱桃4个，桃、石榴、葡萄、柚、橙、枣各2个，枇杷、无花果、香蕉、杏、黑穗醋栗、醋栗、油橄榄、扁桃及木瓜各1个，涉及19个果树品种。,3,我国自60年代开始果树诱变育种，至90年代共育成10个品种,中国农科院柑桔研究所-,418红桔、中育7号、中育8号,西新广农场-,新光雪橙,青海农科院园艺所-,东垣红苹果,内蒙古园艺所-梨,品种朝辐1号、2号、10号、11号和辐射向阳红。,可见，诱变育种在创造园艺植物品种方面还是有很大潜力的,4,第一节 诱变育种的意义和类别,一、意义,1.,改良单基因控制的性状,2.提高突变频率,3.丰富原有的基因库,4.改变植物的育性,5.改变植物有性交配的亲和性,6.缩短营养系品种的育种年限,5,1.,改良单基因控制的性状,诱变育种适于,进行个别性状的改良品种修缮,许多优良品种，只是个别性状存在缺陷。在杂交育种时，基因会发生分离和重组，有时会引起优良性状组合的解体。另一方面，由于基因间的连锁关系，可能引起优良性状夹带不良性状。,诱变处理，可产生,点突变,（point mutation），可改变品种的个别不良性状。对高度杂合的无性繁殖的园艺植物更有意义。,应用原则：,如：,辐射诱变得到的苹果短枝型突变体，既保留了原品种的优良性状，又获得了矮化型变异。,6,2.提高突变频率,辐射诱变，可使变异频率较自然变异（一般是万分之几至十万分之几）,提高1001000倍,，为选择提供了丰富的材料,7,3.丰富原有的基因库,变异的类型多、范围广（有形态变异、结构变异、生理生化变异等,果树、蔬菜类，要求获得果实或营养体的综合性状好，而观赏植物的花、叶、果都有观赏价值，只要叶型、花型、花色、株型等发生突变，都能构成观赏效果。所以，,观赏植物诱变育种更易收到效果。,另外，对于不能用种子繁殖的无性繁殖植物，诱变育种提供了一条有效途径。,8,4.改变植物的育性,花粉污染问题辐射诱变不育系,西伯利亚百合,9,10,东方百合,11,12,13,5.改变植物有性交配的亲和性,自交不亲和诱变自交亲和,解决果树授粉问题,花粉、花器官辐射处克服远缘杂交不亲和,14,6.缩短营养系品种的育种年限,尤其是对童期长、高度杂合、可进行无性繁殖的果树，可省去杂交、播种等复杂程序以及漫长的童期等待过程。,对诱变处理后发现的优良性状，可通过嫁接等方法固定，并进行鉴定。,果树杂交育种，一般20-30年；,辐射诱变，一般10年左右。,15,局限性,变异的方向和性质难以掌握,诱变产生的突变多为劣变，有利变异很少。,变异的方向和性质很难进行有效的预测和控制。,16,二、诱变育种的成就,诱变育种用于花卉育种的最多,核技术的发展和新化学诱变剂的发现诱变育种得到较为广泛的应用。,无性繁殖植物占比重大。,17,早乔纳金,山东青岛市农科所1981年用快中子处理乔纳金休眠枝诱变育成。,生长习性与乔纳金基本一致，生长势较弱。早果性强，风味同乔纳金，品质上，果实成熟期9月上旬，正值中秋佳节上市。,18,金二十世纪梨,属,砂梨,系统，又名王子二十世纪,该品种系日本育种家西田光夫先生通过二十世纪梨进行辐射诱变成培育成的最新品种,于1990年正式命名，并获日本农林水产省种苗登记。我国于1992年引入，经8年观察，专家评议认为是今后梨树发展极有希望的新品种,19,三、诱变育种的类别,1、物理诱变,2、化学诱变,3、其他因素,20,1、物理诱变,辐射诱变,电离辐射,电离辐射：穿透力很强的高能辐射，穿过介质时使介质发生电离，具有特殊的生物学效应,X射线、,射线、,粒子、中子、,激光,离子注入,N,+,、C,+,、Ag,+,、Ar,+,低能离子,太空诱变,变异幅度大、频率高，稳定快,极端温度（极端低温）,极地和高寒地带植物突变率高,21,太空育种,是利用太空环境的高真空、微重力、强辐射、交变磁场及其它因素的综合作用，致使植物体内染色体等遗传物质发生突变，从中选择优良的突变个体。,大青杨太空育种主要是解决耐寒性和速生性的问题。前苏联曾做过类似的太空育种，其速生性提高30。,据了解，大青杨是生长在中国东北小兴安岭的一种杨树。这3000粒树种总重只有2克，被包装在3个试管中，2002年12月30日随神舟四号飞船升空，经过160多小时的太空遨游，于2003年1月5日返回地面。,22,航天育种培育出高产,太空椒,.,利用卫星搭载农作物种子,，开展空间育种技术研究和探索，是发展现代农业的一项全新尝试。,黑龙江省农业科学院园艺分院生物技术中心采用航空诱变育种途径培育而成的高产太空椒。,23,2、化学诱变,概念,应用特殊的化学物质诱发基因突变,和染色体变异。,效应诱导多倍体（倍性育种）；,诱发基因突变；,诱发染色体断裂。,化学药剂,烷化剂类、碱基类似物,等。,作用机理,参与细胞内生化反应而起作用,24,3.其它因素,自体突变,现象,月见草种子老化能增加突变率,金鱼草缺乏某些营养元素会引起突变,组培再生植株突变频率高,陈种子诱发突变,生物体或细胞内部因素,25,第二节 辐射诱变,一、辐射源和辐射剂量,二、辐射诱变机理,三、辐射处理的方法,26,一、辐射源和辐射剂量,（一）辐射源,1.X射线：,X光机,2.,射线：,60,钴、,137,铯及核反应堆,3.,粒子,：,32,磷、,35,硫,4.,中子,：核反应堆、加速器或中子发生器,5.,激光：,激光器,6.紫外线（UV）：,紫外灯,27,（二）辐射剂量,剂量单位,对辐射测量的方式,对辐射在空气中的效应的测量辐射量,对被照射物质所吸收能量的测量吸收剂量,对辐射源本身的测量放射性单位强度,剂量率,单位时间所辐射或吸收的剂量,28,1.辐射剂量和辐射剂量率：,符号X；适用于,X射线、,射线,单位：C/kg；剂量率：C/(kgs),2.吸收剂量和吸收剂量率：,符号D；适用于,、,中子,等任何电离辐射,；,单位：Gy（戈瑞）；1 Gy=1J/kg；,剂量率：Gy/h、Gy/min、Gy/s,3.粒子注量和注量率：,1）,Gy表示；2）注量：n/cm,2,；注量率：n/（cm,2。,s）,4.放射性强度：,Bq（贝可）单位时间内核衰变数目,（二）辐射剂量,29,30,31,（一）辐射生物学作用的时相阶段,（二）辐射对染色体和DNA的作用,（三）植物对辐射损伤的修复,（四）辐射敏感性,二、辐射诱变机理,32,（一）辐射生物学作用的时相阶段,Dertinger和Jung1970年提出，4个时相阶段,1.物理阶段：,电离、激发,2.物理-化学阶段：,自由基,3.化学阶段：,生物大分子反应,4.生物学阶段：,生化过程改变，细胞结构组成变化,33,物理阶段,：主要特征是辐射能量使生物体内各种分子发生电离（产生自由电子）和激发（把束缚电子激发到更高的能级）。,物理,-,化学阶段,：主要特征是通过电离的分子重排，并产生许多化学性质很活泼的自由基（具高能）。,34,OH,.,+OH,.,H,2,O,2,2OH,.,+O,2,2HO,2,.,H,.,+O,2,HO,2,.,H,2,O,辐射,H,2,O,+,+e,-,H,2,O+e,-,H,2,O,-,H,2,O,+,H,+,+OH,.,H,2,O,-,OH,-,+H,.,35,化学阶段,：这一阶段是自由基的继发作用，自由基与生物大分子发生反应，引起分子结构的变化。,生物学阶段,：细胞内生物化学过程发生改变，从而导致各种细胞器的结构及其组成发生变化，包括染色体畸变和基因突变，产生遗传效应。,36,（二）辐射对染色体和DNA的作用,1.辐射生物体,直接作用：射线生物大分子,间接作用：射线水自由基生物大分子,2.辐射染色体,引起染色体畸变和基因突变,；染色体数目改变,3.辐射DNA,氢键断裂、糖与磷酸基断裂、交联现象,DNA受辐射后引起的异构现象，会导致有机体性状变异。,37,（三）植物对辐射损伤的修复,生物体自我修复能力,抑制修复体系，提高突变频率,EDTA，咖啡因，BUdR,38,（四）辐射敏感性,植物不同种类和品种，敏感性不同,染色体DNA含量决定敏感性：DNA含量越多越敏感,多倍体比二倍体更抗辐射,植物组织器官、发育阶段和生理状态不同，敏感性不同,根枝条种子；,性细胞体细胞；,幼龄植株老龄植株,39,三、辐射处理方法,（一）照射材料的选择,1.种子,使用最普遍。,处理量大、便于运输、操作简单。,辐射处理种子及时播种（贮存效应）,2.营养器官和植株,无性繁殖园艺植物常用。,枝条、块茎、鳞茎、球茎等,多年生果树：结果早，鉴定快。照射后嫁接或扦插繁殖,3.,花粉和子房,最大优点：很少产生嵌合体,4.离体培养材料,可避免和减少嵌合体的形成。,辐射单倍体诱发突变，无论显隐性，都能在细胞水平或个体水平上表现出来，经加倍可获得二倍体纯系。,40,（二）适宜剂量及剂量率的选择,1.在一定范围内增加剂量可以提高突变和突变谱，但超过一定范围后增加剂量会降低成活率和增加不利突变率。,2.剂量选用原则,：,活后代有一定成活率,变在成活个体中有较大的变异效应,优变异的个体中有较多有利变异,41,临界剂量,被照射材料的存活率为对照的40的剂量值。,LD50(半致死剂量)-,辐照后存活率为对照的50的剂量率。,高剂量造成大量死亡；选择几率降低；造成染色体损伤较大，导致有害突变比例大大增加。,预备实验：,不同剂量梯度，枝条辐射后插于瓶内，20 34周，统计萌芽率。,42,（三）辐射处理方法的选择,1.外照射,材料不含辐射源，环境无污染,，,首选,急性照射短时间内完成总照射剂量,慢性照射较长时间内完成总照射剂量,重复照射几个世代中连续照射,2.内照射,剂量低，持续时间长，多数植物可在生育阶段进行；蜕变效应；,需要防护,浸泡法,注射或涂抹法,饲喂法（或施肥法）,43,第三节 化学诱变,一、常用化学诱变剂及其机理,二、化学诱变方法,三、影响因素,有关化学物质：,具诱发基因突变和染色体断裂效应，使生物产生遗传性变异的化学药剂,种类有：,秋水仙素，烷化剂类，核酸碱基类似物及其他诱变剂。,44,一、常用化学诱变剂及其机理,（一）烷化剂最重要的一类诱变剂,带有一个或多个活泼的烷基,通过烷基置换取代其他分子的氢原子“烷化作用”,作用机制,它们借助于磷酸、嘌呤、嘧啶基的烷化而与DNA或RNA起作用，进而导致“遗传密码”的改变。,作用重点是核酸,45,1,.烷基磺酸盐和烷基硫酸盐类：,如甲基磺酸乙酯（,EMS,），,硫酸二乙酯（,DES,）。,2.,亚硝基烷基化合物：,如亚硝基乙基脲（,NEH,），,N-,亚硝基,-N-,乙基脲烷（,NEV,）。,3.,次乙亚胺和环氧乙烷类：,如乙烯亚胺（,EI,）。,4.,芥子气类：,包括氮芥类和硫芥类。,（一）烷化剂,46,这类药剂以,化学结构上与核酸碱基（,A,，,G,，,C,，,T,）,相似的特点,，可以在不妨碍,DNA,复制的情况下，作为组成,DNA,的成分而掺入到时,DNA,中去，由于它们在某些取代基上与正常碱基不同，造成碱基配对的差错，而引起突变。,（二）碱基类似物,47,eg,：,5-,溴尿嘧啶（,BU,），,5-,溴去氧尿核苷（,BUDR,），,它们是胸腺嘧啶（,T,）,的类似物，化学结构与胸腺嘧啶极度为近似，由于这个特点，,5-BU,，,BUDR,便能够冒名顶替，掺入到,DNA,链的某一个胸腺嘧啶的位置上，引起遗传密码复制的差错，而造成突变。,另外，,2-,氨基嘌呤（,AD,）,是腺嘌呤（,A,）,的类似物；马来酰肼（,MH,）,是尿嘧啶（,U,）,的异构体。,48,（三）其他诱变剂,a,、,脱氨剂：,如,亚硝酸（,HNO,2,）,在,pH5,以下的缓冲液中，能使,DNA,分子的嘌呤和嘧啶基脱去氨基，使核酸碱基发生结构和性质改变，造成,DNA,复制紊乱。,eg,：,A,和,C,脱氨后分别生成,H,（,次黄嘌呤）和,U,（,尿嘧啶），这些生成物不再具有,A,和,C,的性质，因此，复制分别与,C,和,A,配对，遗传密码因此而改变，遗传性状随之也发生改变。,49,b,、,此外，,羟胺（,NH,2,OH,）、,氮蒽、叠氮化钠（,NaN,3,）,等物质，均能引起染色体畸变和基因突变。尤其是叠氮化钠在一定条件下可获得较高的突变频率，且相当安全，无残毒。,50,51,52,53,二、化学诱变方法,（一）药剂配制,（二）材料预处理,（三）药剂处理,（四）处理后的漂洗,54,（一）药剂配制,一般,一定浓度水溶液,水中难溶,助溶剂,不稳定,现配现用,磷酸缓冲液中使用,亚硝酸不稳定：亚硝酸钠加入到Ph4.5的醋酸缓冲液中,氮芥,55,（二）材料预处理,干种子水预先浸泡,使细胞代谢活跃，提高种子对诱变剂的敏感度,提高细胞膜透性，加快对诱变剂吸收速度,浸泡时间长短取决于材料到达S阶段所需时间,层积处理,56,（三）药剂处理,浸渍法；,涂抹或滴液法；,注入法；,熏蒸法；,施入法,57,（四）处理后的漂洗,漂洗的重要性：,经药剂处理后的材料必须用清水反复冲洗，使药剂残留量尽可能降低，以,终止化学诱变作用，避免增加生理损伤。,漂洗时间：一般1030min或更长。,清洗剂：硫代硫酸钠等。,漂洗后的材料,立即播种或嫁接,需要暂藏的种子应干燥后贮藏在0保存。,58,三、影响化学诱变效应的因素,药剂特性 材料遗传类型和生理状态,1.,药剂浓度和处理时间：,低温下，低浓度长时间处理,2.,温度,影响诱变剂水解速度，先低温后高温,3.,溶液pH及缓冲液的作用,使用一定pH的磷酸缓冲液，可显著提高诱变剂在溶液中的稳定性，浓度不超过0.1mol/L,4.,安全问题,59,第四节 理化诱变因素的复合处理,一、辐射诱变和化学诱变的比较,二、辐射诱变和化学诱变方法的选择,三、理化诱变因素的复合处理,60,1、不同诱变方法的特异性,1,）作用方式不同,2,）诱变效果不同,3,）诱变方向不同,4,）可操作性不同,61,62,三、理化诱变因素的复合处理,优点：在应用射线、中子、激光等处理之后，再用化学诱变剂处理，由于射线改变了生物膜的完整性和渗透性，从而有助于化学诱变剂的吸收。另一方面，物理和化学因素的复合处理，能发挥各自的特异性并起到相互配合的作用，可不同程度地起到减轻辐射损伤，提高突变率的效果。,63,eg：中国葛察明等（1990）用150Gy,射线+2*10-3mol/lNaN,3,处理大豆，M2代突变频率较单一处理提高27.3%。,64,第五节 诱变材料的分离与选择,一、有性繁殖植物,（一）种子处理,（二）花粉处理,二、无性繁殖植物,（一）多年生木本,（二）多年生草本,（三）突变体的分离与选择技术,65,一、有性繁殖植物（一）种子处理,1,.M1的种植和种子采收,：诱变处理种子长成的植株或直接诱变处理的植株，均为M1世代。,2.,M2的播种及鉴定,：M2代是各种突变性状显现的世代，所以是重要的选择世代。,66,3.M3的种植和选择：,M3代仍是突变性状显现的世代，选择应继续进行。,（1）株系性状优良而且表现一致，可按株系采种，下一代进入品比和多点试验，进行特性及产量鉴定。,（2）如果M3株系中继续出现优良变异，应继续进行单株选择和采留种，直至获得稳定株系。,67,一、有性繁殖植物（二）花粉处理,1 选育出变异的单倍体植株：,其后代的培养和选择可参考倍性育种。,2 用来授粉而获得变异植株,：授粉后代播种选育的基本程序可参照种子处理后的培育和选择。,68,二、无性繁殖植物,（一）多年生木本,（二）多年生草本,（三）突变体的分离与选择技术,69,（一）多年生木本,以苹果为例：,将诱变处理过的枝条，嫁接在成年植株或砧木上，由接穗上的芽萌发的初生枝为VM1。一般畸形发展，不进行选择，而进行分离。,对VM1上的芽进行转接或对株系进行短截。VM2是选择突变体的主要世代，选择时除针对主要目标外，还必须综合考虑其它栽培性状。,70,诱变处理的枝条,嫁接/扦插,VM,1,转接/扦插,VM,2,71,72,73,（三）突变体的分离与选择技术,1.,分离原因,：,无性繁殖系在诱变育种中存在着：,嵌合体干扰。,与种子繁殖相比处理群体小。,田间评选优良基因型需较长长时间。,74,（三）突变体的分离与选择技术,2.分离原理：,研究指出，果树休眠芽内基部叶原基的叶腋分生组织中细胞数少，经诱变处理可产生较宽的突变嵌合体。,其次，突变体是否有机会通过萌芽而参与枝条的形成，是突变体被发现的关键。,75,（三）突变体的分离与选择技术,分离方法：,（1）分离繁殖法,eg：Donini在樱桃上发现第56芽获得8.41%最高突变率，而第12芽和第1112芽仅获得5.09%和5.83%突变率。,（2）短截修剪法,（3）不定芽技术,eg：S.Bnertjes等用射线处理非洲紫巨萱层等植物叶片，分化不定芽并进而长成植株，获得30%植株是同型突变体。,（4）组织培养法,76,77,