实用ELISA教程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Elisa,实用操作手册,给师弟科普,ELISA,基本步骤。与其写个文档，不如直接写帖子，反正工作量一样。我自己做,ELISA,也只是初学者，所以说得不对的地方，请大家多多指正。,ELISA,有白底（上图，不可拆）和黑空板子（可拆，,8,个一排，,12,排）。用吸光度（一般是,450nm,的,OD,值）来检测，就只能用白底的板子。黑底的板子可以用,Lumin,读数。第一步，拿到板子，还有封盖膜。,第二步：用,100ul,包被抗体，包被好板子之后，轻弹混匀。将封盖膜的白色撕去，用透明有粘性的膜，贴在板子上，把膜压紧（贴膜是为了防止液体挥发，所以一定要把每孔黏牢）。室温孵育过夜。注意事项：,1.,如果一次只做一部分孔，贴膜可以剪刀剪开，只用一部分。保证膜可以把加液后的孔盖住就可以。,2.,加样时候，一定要保证每孔加样量完全一样。避免因为操作原因，每孔液体量有区别。,ELISA,比较敏感，操作误差会导致最后读数有不小的差别。,3.,加的样，保证样品加在孔底，不要粘在管壁上，减少孔与孔之间的差异。,第二天早上，来洗掉包被液。注意事项：,1.ELISA,用的所有液体系统，记得一定要预先调,PH,值到,7.2-7.4,之间，最好按照说明书都无菌过滤过。,1XPBS,的,PH,值在,7.68,左右，仍然需要加盐酸调酸一点。,Trizma base,配出来，,PH,在,9.98,必须调,PH!,否则,ELISA,中抗原抗体根本不能正常结合。蛋白对于,PH,值极度敏感。,2.,无菌要求多高，现在不知道。建议无菌配好的液体放在,4,度冰箱保存。每次用之前，放在室温下至少,15,分钟。,ELISA,用的液体，室温的温度，效果比较好。洗包被液的时候，直接把板子翻过来，弃掉液体。在厚厚的吸水纸上，用力拍打板子，力求把孔中的液体完全弃干净。用,WASH BUFFER,洗涤三次。因为孔的最大容量是,400UL,但是,300UL,基本就可以把孔覆盖满。所以，建议洗板子的时候，每孔加,350ul,左右。注意事项：,1.,每次洗涤的时候，尽量拍干孔中液体。这样洗涤得比较干净。,2.,孔中没有液体时候，动作一定要快！,ELISA,包被后的孔，绝对不能干掉！否则非常影响结果。,3.,封闭。用是,1%BSA in 1XPBS.,无菌过滤，,4,度保存，用之前放在室温复温。封闭液最好可以封闭全孔，所以每孔加,300UL,封闭液，室温,1,小时。,4.,弃掉封闭液，拍干。洗涤三遍。步骤如前,。,5.,加标准品和样品。标准品储存浓度很高，而且蛋白很忌反复冻融。建议第一次使用时，分装。可以,48,孔一只，,-80,度冰箱保存，可以有效保存半年。,4,度保存，有效期是,60,天，而且浓度会衰减。,取,16,孔标准品的量。举例，我的标准品储存浓度是,270ng/ml,标准品分,7,个点，最高浓度是,1000pg/ml,，每孔,100ul,2,倍递减，所以是,1000,，,500,，,250,，,125,，,62.5,，,31.2,，,15.6 pg/ml,7,个孔我需要,0.2ng,标准品。做,ELISA,必须有复孔。所以，两排,14,个孔我需要,0.4ng,标准品,1.5ul,。,标准品稀释步骤：取,7,个,EP,管，第,1,管放,400ul,缓冲液，第,2,到,7,管放,200ul,缓冲液。将,1.5ul,标准品加入到第一管中，,200ul,枪轻轻吹打混匀。从第,1,管中取,200ul,加入第,2,管中，吹打均匀。依次稀释。第,7,管有,400ul,液体，最后只用,200ul,。标准品加样步骤：从第,1,管中取,100ul,加到,A1,孔，再,100ul,加到,A2,复孔中。第,2,到,7,孔，参考上述步骤。第,8,孔，,H1,和,H2,加没有标准品的缓冲液，作为阴性对照。样本加样：血清或者细胞上清，解冻之后混匀，建议,3000RPM,离心,10,分钟，沉淀液体中的固体杂质。按照顺序，每孔加,100ul,样本，记得做复孔。加样体积一定要一样，但是动作要快。样本还是一定要保证加到管底，不要粘附到管壁上。,标准品和样品，每孔,100ul,，室温孵育,2,小时。,6.,弃掉液体，拍干。洗涤,3,遍。,7.,加检测抗体（,detection antibody,尾端有生物素,biotin,），每孔,100ul,（储存液也是放,-80,度，用之前解冻后加缓冲液混匀，稀释到工作浓度，缓冲液的,PH,值都已经调到,7.2-7.4,之间）。室温孵育,2,小时。备注：以上这些步骤没有要求避光。所以，每次加样之后，只要保证把贴膜都贴牢，防止液体蒸发和孔间干扰即可。板子可以放在操作台上。不过因为操作习惯，即使不避光的步骤，也可以把板子放在室温的抽屉里。,8.,弃掉检测抗体液，拍干。洗涤三遍。,9.,加,Streptavidin-HRP(,亲和素,-,辣根过氧化物酶,),，这个一直,4,度保存，使用的时候,200,倍稀释（,96,孔，,9.6ML,液体，加,48ul,的,Streptavidin-HRP,，,9552ul,的缓冲液）。,100ul,每孔，室温，避光（这步开始要避光），孵育,20,分钟。,10.,弃掉液体，拍干。洗涤三遍。,11.,加底物液（,substrate solution,）,A,液：,B,液,=1:1,，用之前临时混起来。储存的时候,A,，,B,两液分别储存在,4,度冰箱。每孔,100ul,（等于每孔,A,液,50ul,，,B,液,50ul,），室温，避光，,20,分钟。,说明：,1.,加,AB,液之后，白色的孔就会显色。淡绿色，颜色深浅跟目标蛋白浓度正相关。,2.,生物素与亲和素结合，可以放大免疫反应的效应，便于显色。,3.ELISA,包被的板子采用平底（,flat,），大概,60,个,96,孔板，,260,美元左右。白色的板子虽然不能拆卸，但是不用的孔，只要别污染，下次可以用，所以一块板子等同于可以拆开来用。,12.,保留,AB,液在孔内，直接每孔加,50ul,的终止液（,2N H2SO4,）。终止液也是公司买的专门,ELISA,用的。加完终止液，轻弹板子，混匀。可以看见淡绿色变为亮黄色。黄色的颜色深浅，与绿色一致，与目标蛋白的浓度成正相关,。,加完终止液，立即到机器上读数。选择,450nm,，测,OD,值。说明：不常做,ELISA,的实验室，请务必在实验之前，确认吸光度检测仪器在正常使用状态。如果仪器状态不好，读数不准，,ELISA,的结果也不可信。附图的板子颜色，是我昨天的结果，室温放了一个晚上之后，今早来看，,颜色普遍都黄色，虽然还有颜色深浅的区别。刚做出来的时候，颜色淡的近乎白色，几乎没有黄色。,X,Y,轴都取对数之后，可以看见点与点之间成直线。但是，,R2,只有,0.967,，一般比较好的标准曲线，应该是,0.99,左右。,D1,与,D2,的重复性不好（标准品浓度，,125pg/ml,），可能是个人操作原因。根据标准品得到的公式，就可以根据,OD,值来计算各个样本检测浓度。,关于,ELISA,标本收集：,1.,血清：室温血液自然凝固,10-20,分钟后，离心,20,分钟左右（,2000-3000,转,/,分）。收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。,2.,血浆：应根据试剂盒的要求选择,EDTA,、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，加入,10,（,v/v,）抗凝剂,(0.1M,柠檬酸钠或,1%heparin,或,2.0%EDTA.Na2),混合,10-20,分钟后，离心,20,分钟左右（,2000-3000,转,/,分）。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。,3.,尿液：用无菌管收集。离心,20,分钟左右（,2000-3000,转,/,分）。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。,4.,细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心,20,分钟左右（,2000-3000,转,/,分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心,。,样品稀释的一般原则,用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于,ELISA,试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量高、中、低的不同，分别采取不同的稀释方案：,高,指待测因子在,40-400ng/ml,。一般按,1,：,100,稀释。,297,样品稀释液加,3,样品。,中,指待测因子在,4-40ng/ml,。一般按,1,：,10,稀释。,225,样品稀释液加,25,样品。,低,指待测因子在,62.5,4000pg/ml,。按,1,：,2,稀释。,100,样品稀释液加,100,样品。,特低,指待测因子,62.5pg/ml,。样品一般不做稀释，或按,1,：,2,稀释。,样品的稀释应有详细记录。,