生物化学与分子生物学实验(终版)优质公开课.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物化学实验技术,生物技术专业实验室,王小英,实验内容,生物化学实验基本操作,实验一 双缩脲法测定血清蛋白质含量,实验二 血清丙氨酸氨基转移酶的测定,1、掌握刻度吸量管及分光光度计的使用方法。,2、,掌握分光光度法测定物质含量的方法,。,3、熟悉实验室规则，实验报告的书写要求。,4、了解,分光光度法的基本原理和溶液的混匀方法。,一、实验目的,生物化学实验基本操作,实验前必须认真预习。不旷课、不迟到、不早退。,进入实验室要穿白大衣，严禁穿拖鞋进实验室，严禁实验室内进食。,自觉遵守实验室纪律，保持实验室安静。不要随意走动和摆弄与本次实验无关的仪器和物品。,认真按照实验步骤和操作规程进行。详细记录实验数据，实验完毕及时整理实验数据，并提交实验报告。,（一）实验室规则,要爱护仪器，使用贵重精密仪器应严格遵守操作规程。实验完毕及时在仪器记录本上登记，如仪器发生故障应立即报告指导老师，未经许可不得自己随意检修。,实验完毕后，个人必须整理自己的实验台面。值日生负责做好实验室的卫生，检查并关好水、电、门、窗。,3、,使用注意事项,（1）选管：所用吸管规格最好应稍大于或等于所吸的液体量。,（2）抹管尖：在吸血清、标准液时，应用滤纸抹去管外多余的液体。,（3）吹管：刻度吸量管注明“吹”字的应吹出残液。,（4）读数：液体弯液面的最低点、刻度线上缘与视 线在同一水平上。,（5）洗管：吸血清的吸管，应及时洗清。,（四）溶液的混匀,1、指弹法,2、旋转混匀法,3、颠倒混匀法,4、涡旋振荡器混匀法,5、玻棒搅拌混匀法,（五）分光光度计,是运用分光光度法（即比色法）测定物质含量的一种装置。,分光光度法：是根据物质对光的选择性吸收及光的吸收定律，对物质进行定性、定量的分析方法。它的理论依据是Lambert-beer定律,（1）透光率（T）和吸光度（A）,I,0,I,a,I,t,用 表示光线透过溶液的能力，称为透光率(,transmitance,T,),透光率的负对数称为吸光度（absorbance,A）,1、分光光度法的原理,A,lgT,（2）,光的吸收定律,LambertBeer定律,A=KCL,定义：,一束单色光通过介质溶液后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。,A：为吸光度,C：为溶液浓度,L：为溶液层厚度,K：为吸光系数,2、定量分析方法,（1）标准曲线法,标准曲线（A-c曲线）,（2）标准对比法（三管法）,A样K样c样L样,A标K标c标L标,同台仪器，相同厚度吸收池及同一波长测定，故,K,样,K,标,，L,样,L,标,，所以：,光的互补示意图,3、选用何种单色光通过溶液?,互补色光,：两种适当颜色的单色光按一定强度比例混合可成为白光，这两种单色光称为互补色光,4、分光光度计的基本结构：,光源,单色器,吸收池,检测器,指示器,分光光度计的基本结构图,5、722型分光光度计的操作方法,接电源，开开关，预热30分钟（打开暗盒）；,选波长，选择开关置于“T”，“调0”点；,盛空白，装样品，关暗盒，调“100%”；,将选择开关置于“A”，拉动拉杆，记读数；,取出比色杯，关上暗盒及开关，拔掉电源；,6、注意事项,（1）,为了防止光电管疲劳，不测定时必须将比色槽暗箱盖打开，使光路切断，以延长电管使用寿命。,（2）手拿比色杯粗面，装液量一般占比色杯体积的2/33/4；,（3）本型仪器,A值在0.10.8,之间误差较小，准确度较高。,实验一 双缩脲法测定蛋白质含量,P,135,一、实验目的,1、掌握双缩脲法测定蛋白质的原理及操作方法,2、了解血清总蛋白测定的临床意义,二、实验原理,什么是肽键？,什么是双缩脲？,O,2,NH,2,-C-NH,2,H,2,N-CO-NH-CO-NH,2,+NH,2,尿素,双缩脲,（-CO-NH-）,双缩脲反应,三、实验步骤,1、“三管法”，取中号试管3支，按下表加入试剂：,加入物（mL）,管号,测定管,标准管,空白管,待测溶液,0.05,蛋白标准液,0.6,0.9%NaCl,2.95,2.4,3.0,双缩脲试剂,3.0,3.0,3.0,37保温10分钟，722-分光光度计540nm波长以,空白管,调节零点比色，记录各管吸光度。,2、待测溶液蛋白含量计算：,例如，已知蛋白标准液蛋白质含量为5mg/mL，则（标准管）蛋白含量为1mg/mL，计算待测溶液蛋白含量为：,1mg/mL60（稀释倍数）=mg/mL,四、注意事项,血清及标准液取量应准确（刻度吸管的使用注意事项）。,须于显色后30min内测定。,五、临床意义,正常成人血清总蛋白含量为：60-80g/L。,血清总蛋白增高：,（1）血液浓缩，导致总蛋白浓度相对增高；,（2）血浆蛋白质合成增加：主要见于球蛋白合成增加，如多发性骨髓瘤患者。,血清总蛋白降低：,（1）血液稀释，导致总蛋白浓度相对降低；,（2）消耗增加：如甲状腺功能亢进，恶性肿瘤等。,（3）蛋白质丢失：如肾病综合征病人大量蛋白从尿液中丢失。,六、思考题,蛋白质测定的方法有哪些？请简述其原理？,实验二 血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定赖氏法,P,148,一、实验目的,1、掌握血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的基本原理及方法。,2、了解血清丙氨酸氨基转移酶测定的临床意义。,ALT测定方法,速率法,手工法,赖氏法（30min）,金氏法（60min）,穆氏法（60min）,三种方法的测定原理、操作、试剂和采用温度等方面均完全相同，只是酶与底物反应的时间与正常参考范围不同。,二、实验原理,丙氨酸,-酮戊二酸,丙酮酸,谷氨酸,1、转氨基作用,2、显色反应,=505nm,加入物(ml),测定空白管,测定管,血清,0.1,0.1,基质缓冲液,0.5,混匀后，置37保温,30min,2,4二硝基苯肼溶液,0.5,0.5,基质缓冲液,0.5,混匀后，置37保温20min,0.4mol/L NaOH溶液,5.0,5.0,1、测定管及测定空白管的制备,三、实验步骤,加入物(ml),试剂空 白管,标准管,0.1mol/L磷酸盐缓冲液,0.1,0.1,2.0mmol/L丙酮酸标准液,0,0.05,基质缓冲液,0.50,0.45,2,4-二硝基苯肼溶液,0.5,0.5,混匀，37水浴20min,0.4mol/LNaOH溶液,5.0,5.0,2、标准管及试剂空白管的制备,3、室温放置5min，在波长505nm处以,蒸馏水,调零，读取各管吸光度。,四、实验结果,【参考范围】525卡门氏单位。,测定管吸光度,测定空白管吸光度,标准管吸光度,试剂空白管吸光度,=,28,（卡门氏单位）,酶活力计算：,不做标准曲线时，可以做28卡门氏单位的标准管，按下式计算：,五、注意事项,1、吸血清、标准液的量要准确。,2、充分混匀使反应充分。,3、酶促反应的时间要把控好。,4、严重脂血症、黄疸及溶血血清可增加测定的吸光度，应作血清标本对照管,六、临床意义,ALT广泛存在于一般组织细胞中,肝细胞中此酶含量最多。肝炎、中毒性肝细胞坏死等肝病时，血清中此酶活性增加。因此，测定血清ALT的活性对肝脏疾病的诊断有很大意义。,七、思考题,1、血清丙氨酸氨基转移酶的测定有何临床意义？,2、血清丙氨酸氨基转移酶的测定有何注意点？为什么要避免溶血？,