第二章化学分析 2.ppt

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,第二章 化学分析,contents,酸度的测定,4,水分的测定,1,糖类的测定,2,氮的测定,3,一、水分的测定,在营养六大类里，水分又排在其它五大类（碳水化合物、蛋白质、脂肪、无机盐和维生素）之首。,水分在工业发酵中是一个极为重要的分析项目。水分测定对于计算生产中的物料平衡和实行工艺监督等方面，有很重要的意义。,控制原料（大米、大麦、酒花的水分含量）；入窖池酒醅的水分含量；产品的水分含量，关系到产品品质的保持和产品稳定性的提高。例如原料中（淀粉）水分过高，原料在贮藏时容易发霉变质，影响原料的利用价值。麸曲白酒生产中，入池酒醅水分高低，直接影响白酒的质量。发酵产品，如味精中水分，是一个重要的质量指标。,一、水分的测定,对于一些发酵废水、废液，质量标准常列入固形物的含量。所谓固形物，是指将产品或废液中的水分排除以后的全部残留物，其组合有蛋白质、脂肪、粗纤维、无氮抽出物和灰分等。直接测定非糖固形物的方法，也就是间接测定水分的方法，反之也一样。,即：固形物（,%,）,=100,水分（,%,）,非糖固形物,=,总固形物,总糖,1,一些发酵产品和原料中的水分含量,(,一,),发酵产品：,酒精,50%,酶制剂（如糖化酶）,:12%14%,；,高、中温曲：,14%16%,；,小曲,(,酒药,),：,12%14%,(,二,),原料，淀粉质原料,:,原料中水分不能高于,13%,，否则不能贮存，易发生霉变，呼吸损失大,大麦,13%,；,大米,11%13%,；,玉米,11%13%,；,薯干、木薯,12%14%,；,小麦,11%13%,；,高粱,11%13%,啤酒花,10-13%,注：新采收的啤酒酒花花朵含水分,75-80%,，先用热空气干燥至水分为,6-8%,，使花梗脱落，再经人工回潮至,10%,左右后打包。,1,一些发酵产品和原料中的水分含量,(,三,),白酒发酵醅与酒精糟,1.,一般的酒：入窖：,54%,茅台酒：封窖,42-43%,（原）,54%,（现）,40,天出窖：,64%,开窖,47%,（原）,58%,（现）,注：做固体发酵的酶制剂培养基含水分大约,60%,左右，不可过高，否则物料将失去应有的疏松结构，变得十分紧密，阻碍空气流通。,2.,酒精糟：,93-95%,糖蜜酒糟：,92-94%,3.,酒精糟干燥饲料：,4.5-9.0%,饲料酵母,9%,注：,DDG,干酒精糟固形物：,7.5%,DDS,干酒精糟滤液固形物：,4.5%,DDGS,干酒精糟固形物和滤液固形物的混合物：,9%,二 水分的存在形式,发酵产品中水分主要有下列,三,种存在形式：,1.,机械结合水：由分子间力形成的吸附水及充满在毛细管或巨大空隙中的毛细管水；,2.,真溶液或胶态溶液的分散介质，如食盐、砂糖、氨基酸、蛋白质或植物胶的水溶液中的水；,3.,化学结合水：如葡萄糖、麦芽糖、乳糖的结晶水或果胶、明胶所形成冻胨中的结合水。这种水是以配价键结合的，其结合力要比吸附水的分子与物质分子间的引力大得多，很难用蒸发的方法分离除去。,三 常见的几种水分测定法,水分测定法通常可分为,直接法,和,间接法,两类。,利用水分本身的物理性质和化学性质测定水分的方法，叫做直接法，如重量法、蒸馏法。,利用产品的比重、折射率、电导、介电常数等物理性质测定水分的方法叫做间接法。,三 常见的几种水分测定法,凡操作过程中包括有称量步骤的测定方法，统称为重量法。如烘箱干燥法、红外线干燥法、干燥剂法等,蒸馏法,加入与水互不溶解的有机溶剂（有的可与水形成共沸混合物）蒸馏出的蒸汽被冷凝，收集于标有刻度的承接管中，冷凝的溶剂回流到蒸馏瓶中而和水分分离,重量法,在一定温度和压力条件下，将样品加热干燥，以排除其中水分的方法叫做烘箱干燥法。它包括常压烘箱干燥法和真空烘箱干燥法。这种测定方法费时较长，但操作简便，应用范围较广。特别是真空烘箱干燥法，常被当作标准法。,重量法,红外线加热法等,.,烘箱干燥法,其他干燥法,1,重量法,烘箱干燥法,(1),应用本法测定水分的样品应当符合下述三项条件,：,水分是唯一的挥发物质；,水分的排除情况很完全；,样品中其他组分在加热过程中由于发生反应而引起的重量变化可以忽略不计。,(2),操作条件的选择,样品的预处理,样品的预处理方法对分析结果影响很大。,在采集、处理和保存过程中，要防止组分发生变化。,固体样品必须磨碎。谷类约为,18,目，其他样品为,30-40,目。液态样品宜在水浴上浓缩，然后用烘箱干燥。,样品重量和称量器皿规格,样品重量通常控制其干燥残留物为,2,克,4,克。,称量皿底部直径：一般为,9,厘米。,1,重量法,烘箱干燥法,(3),干燥条件的选择,烘箱干燥法所选用的温度、压力及干燥时间，因被测样品的性质及分析目的不同而有所改变。,干燥温度通常取,100,105,，对热较稳定的，甚至可以采用,120,140,的温度，这样可以大大缩短干燥时间。,干燥时间的确定方法通常有两种：一种方法是干燥至恒重的方法，即干燥残留物重为,2g,5g,时，当连续两次干燥放冷称重后，两次重量相差不大于,1,毫克,3,毫克；另一种方法，是由规定干燥时间来代替干燥至恒重的方法。所谓规定干燥时间，是指在这个时间内样品内大部分水分已经被除去，而以后的干燥处理，对测定结果改变很少，但是，具体时间应当经过试验来确定。操作条件比恒重法更应严格遵守。,1,重量法,烘箱干燥法,(4),干燥设备,最简便的干燥设备是装有温度调节器的常压电热烘箱。它分为对流式或强力通风式两类，一般采用对流式。烘箱内各部位的温度变动不应超过,2,。或者，可用,4-6,个样品同时检查烘箱，其偏差应为,0.1%0.3%,。为了保证恒温，可使用双层烘箱。,发酵工业生产中淀粉质原料多是用常压电热烘箱进行水分测定的。,使用真空烘箱时，用连续抽气的方法可以降低空气中的蒸汽压，以便提高干燥速率，干燥过程中，最好送入干燥空气，以除去水蒸汽。干燥一定时间后，使干燥空气缓缓流入烘箱，让烘箱内压力恢复至,1,个大气压，以防烘干了的样品又重新吸收水分。常用的抽气器是油泵，使用时应防止水蒸气侵入。,真空烘箱内各部位的温度应当均匀一致，若干燥时间较短，要求更应严格。例如，当干燥温度为,70,，温度差只要相差,1,，对分析结果就会有较大的影响。,发酵产品、味精、酶制剂和果糖的水分多用真空干燥法测定。,1,重量法,烘箱干燥法,(5),干燥器中的干燥剂,无水硫酸钙，无水过氯酸镁，无水过氯酸钡，刚灼烧过的氧化钙，无水五氧化二磷，无水浓硫酸以及变色硅胶，都是比较有效的干燥剂。但因此法时间较长，很少用。,(6),产生误差的原因有,：,样品中水分含量较高，干燥温度也较高时，有些样品可能发生化学反应，如糊精化，水解作用等，这些变化使水分无形损失。为了避免这种现象，可先在低温条件下加热，其后再某一指定温度下继续完成干燥。,样品中有水分以外的其他易挥发物，如乙醇、醋酸。,样品中含有双键或其他易于氧化的基团，如不饱和脂肪酸、酚类等，是残留物增高，水分含量偏低。,2,其他干燥法,为了缩短干燥时间，已试制出一些特殊的仪器。,最令人满意的是红外线加热法。它采用一种低光度的特制钨丝灯，功率,250 W 500W,。辐射热可以穿透样品，达到样品内部的一定深处，这样便加速了水分的蒸发，而样品本身温度升高并不大，钨丝灯与样品的间距是一项重要参数，距离太近，样品会分解，通常取,10,厘米左右。被测样品的厚度为,10-15mm,，在最适条件下，样品干燥时间的最大值为,25,分钟。如白酒酒醅的水分就多是采用红外线加热法，分析时间短，则有利于指导生产。因为工人是等到水分报告出来后才封窖的。,3,计算,式中：,W,0,称量瓶重,W,1,干燥前试样,+,称量瓶重,W,2,干燥后试样,+,称量瓶重,此公式用于一般情况,特殊情况：当淀粉质原料水分大于,16%,时，在原料粉碎过程中水分会有显著损失，因此需在低温下,(60,左右,),预先干燥至水分为,12%14%,，此时测得的水分为前水分。然后将原料粉碎，准确测定其水分，此时测得的水分为后水分。,原料总水分为：,总水分（,%,）,=1,（,1,后水分,%,）（,1,前水分,%,）,x100%,或：总水分（,%,）,=,前水分,+,（后水分,x100,前水分,/100,）,3,计算,必要时尚需考虑原料粉碎时空气湿度校正。,校正方法为：准确称取,5,克已粉碎试样，置入已恒重的称量瓶中，在空气中暴露与试样处理时相同的时间，盖好称重。,三 常见的几种水分测定法,2,蒸馏法,蒸馏法蒸馏法有多种型式。应用最广的蒸馏法，是共沸蒸馏法。加入与水互不溶解的有机溶剂（有的可与水形成共沸混合物）蒸馏出的蒸汽被冷凝，收集于标有刻度的承接管中，冷凝的溶剂回流到蒸馏瓶中而和水分分离。在蒸酒精含量的同时，酒精与水的蒸汽一齐被冷凝，收集于量筒中。通过酒精比重计量出酒精度，剩下的就是水了。,本法对谷类、干果、香料等样品的检验结果较准确。,第二节 糖类的测定,糖的定量测定有,物理法,和,化学法,两类。,物理方法有：测定折光率、旋光度、比重等。,化学方法有：主要是利用游离羰基（醛基或酮基,2,）的还原性，应用氧化还原法进行测定。,所有的单糖都具有游离羰基，称为还原糖。但是双糖中蔗糖无游离羰基，称为非还原糖，需要经过转化为单糖后进行定量。,糖的测定方法：最常用的氧化剂是费林（,Feliling,）试剂,即：用二价铜在碱性条件下被糖还原为一价的氧化亚铜。,使用费林试剂测糖方法甚多，分为重量法、容量法、比色法三类。,糖的测定中，许多方法都不能应用化学方程式计算其结果，需由经验数字换算，或在相同条件下，用标准糖液对照分析。在分析操作时要严格遵循规定的操作方法进行，否则将会引入较大误差。,酸水解粗淀粉的测定及含量计算,1,酶水解法与计算,.,2,第二节 糖类的测定,一、酸水解粗淀粉的测定及含量计算,1,原理,所生成的葡萄糖用斐林试剂测定。斐林试剂由甲、乙液组成。甲液为硫酸铜溶液，乙液为氢氧化纳与酒石酸钾钠溶液。平时，甲、乙液分别存储，测定时，甲、乙液等体积混合。,混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：,2NaOH,+,CuSO,4,=,Cu(OH),2,+,Na,2,SO,4,所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钾钠反应，生成酒石酸钾钠铜络合物，使氢氧化铜溶解。,一、酸水解粗淀粉的测定及含量计算,1,原理,注意：酒石酸钾钠铜络合物中二价铜是一个氧化剂，能使还原糖中羟基氧化，而二价铜被还原生成一价的氧化亚铜沉淀,反应终点用次甲基蓝指示剂显示。因次甲基蓝氧化能力较二价铜弱，故待二价铜全部被还原后，过量的,D,还原糖立即使次甲基蓝还原为无色的隐色体，而显色氧化亚铜的鲜红色。,反应终点用次甲基蓝指示剂显示。因次甲基蓝氧化能力较二价铜弱，故待二价铜全部被还原后，过量的,D,还原糖立即使次甲基蓝还原为无色的隐色体，而显色氧化亚铜的鲜红色。,一、酸水解粗淀粉的测定及含量计算,操作,：,中和定容定糖,因酸水解法不仅使淀粉水解，而且也能分解半纤维素木糖、阿拉伯等单糖粗淀粉多糖，都有还原力，使糖量结果偏高。,计算：,纯淀粉测定：称样,3-5g,250ml,三角瓶,+100ml H2O,于沸水浴中糊化,1,小时，冷至,65,+20ml,酶液（固体曲,100g+90GH2O+10mlpH,醋酸,-,醋酸钠缓冲液，搅拌浸泡,1,小时，过滤滤液即酶液）,55-60,糖化,2,小时加热煮沸,30,分钟冷却至,65,再加,20ml,酶液,55-60,保温糖化至碘液指示剂不呈蓝色为止趁热过滤滤液定容,250ml,取滤液,100ml,250ml,三角瓶,+11ml20%HCL,沸水浴回流,1,小时,20%NaOH,中和至微酸性,250ml,容量并定容,二、酶水解法与计算,用酶水解法测定淀粉含量应认为是最正确的方法。,在一定条件下，用,-,淀粉酶处理样品，则能使淀粉与半纤维素等某些多糖分开来。因为,-,淀粉酶具有严格的选择性，它只能使淀粉液化变成低分子糊精和可溶性淀粉。而对半纤维素不能作用，在用,-,淀粉酶液化，除去半纤维素等不溶性残留物后，再用酸水解使生成葡萄糖，所得结果比较准确。这种酶水解作用，叫做选择性水解。,二、酶水解法与计算,1,原理,（,2,）淀粉的性质,直链淀粉溶于热水，缓慢冷却后易发生凝沉现象。即直链淀粉分子之间，形成分子间氢键，在稀溶液中有沉淀析出，在浓溶液中则结合成凝胶。直链淀粉可与碘生成络合物，呈现深蓝色。,支链淀粉只能在加热加压的条件下，才能溶解于水，静置冷却后，不易出现凝沉现象。支链淀粉遇碘不能形成稳定的络合物，所以，遇碘溶液呈现较浅的蓝紫色。,淀粉的水解液呈右旋性，比旋光度,20,D,为,+201.5,+205,。,淀粉具有晶体结构，淀粉酶不仅能作用于淀粉颗粒，使用酶水解法时，需先使淀粉糊化，在糊化过程中，淀粉颗粒晶体结构被破坏，淀粉就易被淀粉酶作用。,二、酶水解法与计算,1,原理,（,1,）淀粉的分子结构,：,淀粉具有两种不同的分子结构，一是直链淀粉，以,-1,、,4,糖苷键连成直链状；二是支链淀粉，主链以,-1,、,4,，支链以,-1,、,6,键与主链相连。,一般淀粉中均同时含有直链淀粉和支链淀粉两种分子。玉米淀粉含直链淀粉为,27%,，甘薯约为,20%,，其余份为支链淀粉。糯玉米、糯大米和糯高粱的淀粉几乎全部是支链淀粉。有的淀粉，直链淀粉含量可因成丸度的增加而增加。直链淀粉和支链淀粉的性质不同，因此，淀粉中这两种不同分子结构的含量的多寡也影响到淀粉的性质，例如，碘的结合容量及酶降解后的最终产物都有所区别，这对淀粉的测定有很大关系。,二、酶水解法与计算,2,操作,二、酶水解法与计算,3,计算,A,样品中淀粉相当与还原糖的重量（以葡萄糖计）,mg,B,它相当于还原糖的重量（以葡萄糖计）,mg,0.9,还原糖（以葡萄糖计）换算为淀粉系数,W-,样品重量,g,V/100,酸水解稀释为,100m,取,VmL,测定还原糖,二、酶水解法与计算,讨论：,2,次,/,人,滴定,试计算,4,次淀粉测定其真实值的范围（几率,95%,）,淀粉测定中两种方法的比较,1.,酸法,：一般用稀,H2SO4,、,HCL(,不能用,HNO3,易氧化,),，浓酸把单糖破坏成糠醛,优：迅速，简单,缺：一些半纤维素也会被水解成糖类（已糖与戊糖）,淀粉含量改变就不能得到准确的结果,用酸水解得到淀粉含量称粗淀粉含量,2.,酶法,：利用酶的专一性,即双酶法：,优：水解完全，只能是淀粉水解，用酶法水解得到淀粉含量称纯淀粉含量。,缺：时间长，恒温,现在酶法有点演变酸,-,酶法,第三节 氮的测定,1,概述,2,蛋白质定量法,3,氨基酸总量测定,蛋白质的性质,1,原料中蛋白质的含量,2,一些蛋白质的含氮量,3,ThemeGallery is a Design Digital Content&Contents mall developed by Guild Design Inc.,1,概述,（,1,）蛋白质的性质,蛋白质是生命的物质基础，一切有生命的东西都含有不同类型的蛋白质，缺乏蛋白质，生物就不能维持其生活。,蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大，大部分是由几万到数百万，分子的长轴为数纳米,100,纳米（,nm,）。蛋白质主要由碳、氢、氧、氮、硫五种元素组成，在某些蛋白质中还含有微量的磷、铜、铁、碘等。,蛋白质溶解是典型的胶体分散系。全部或大部分分子构造是一种具有光学活性的两性物质，这种两性物质是由氨基酸的肽键相互联结而成。蛋白质可以用酶或酸、碱水解。,水解程度不同含有不同量的氨基酸、酸性酰胺、游离氨和结合氨等组分。,水解中间产物膘、胨、肽氨基酸,细菌污染产生游离氨,氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，蛋白质就是由,20,种不同的氨基酸排列结合而成。其中异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸在人体内不能合成，被称为必须氨基酸。这些必须氨基酸对人体起很重要的生理功能作用，生物体内可能缺乏某一种氨基酸而出现症状或者补充某一种必须氨基酸而加强新陈代谢。,（,2,）原料中蛋白质的含量,蛋白质的发布是不平衡的，因此蛋白质含量是不同的。例如一般植物组织的含量低于动物组织，植物的营养部分（叶、茎、根）中蛋白质的含量很少，一般为,0.5-3%,，在果实中一般为,0.4-1.5%,，大部分集中在种子中，平均可达,15%,，尤其在豆类中，如黄豆中的蛋白质可达,40%,，而在动物中则以肌肉内脏中的蛋白质含量较多。,乳类,肉类,鱼类,谷类,蔬菜类,牛乳,3.3%,黄鱼,17.0%,带鱼,18.1%,稻米,8.3%,黄瓜,0.8%,乳粉,26.2%,猪肉,9.5%,鲐鱼,21.4%,小麦粉,9.9%,柑橘,0.9%,羊肉,11.1%,鲤鱼,17.3%,玉米,8.5%,鸭梨,0.1%,兔肉,21.2%,大豆,40%,油菜（秋,)1.2%,鸡肉,20%,油菜（春,)2.6%,（,3,）,一些蛋白质的含氮量,因为蛋白质的定量是基于测定总有机氮，但某些物质又含有大量的非蛋白氮化合物（如马铃薯等）。这就必须把蛋白质提取出来，分别测总氮及非蛋白氮来求得纯蛋白氮。,蛋白质,=,总氮,6.25,（即蛋白质含氮,16%,）,一般常用：蛋白质换算系数,6.25,小麦粉换算系数,5.70,全小麦、大麦换算系数,5.83,牛奶制品换算系数,6.38,大豆换算系数,5.71,动物胶换算系数,5.55,一些蛋白质中有机氮的含量,蛋白质,氮（克）,清蛋白,15.9,-,淀粉酶,16.23,麦醇溶蛋白（小麦）,17.66,溶菌酶,18.80,色氨酸合成酶,17.5,谷氨酸（小麦）,17.6,球蛋白（南瓜籽）,18.55,玉米醇溶蛋白,16.2,木瓜蛋白酶,17.15,核糖核酸酶,A,17.51,测定意义,1,测定蛋白质的方法,2,ThemeGallery is a Design Digital Content&Contents mall developed by Guild Design Inc.,2,蛋白质定量法,（,1,）测定意义,1,、微生物生长与发酵需要氮源，从原料中得到蛋白质及其分解产物来构成自身的蛋白质。,2,、发酵原料中氮的含量是一个重要指标，如大麦中含氮量的多少，对工艺最有利，太多、太少都不好。蛋白质含量一般要求,9-12%,，蛋白质含量高，制麦不易管理，易生玻璃质、溶解差，浸出物相应地低，成品啤酒及浑浊。,大麦中蛋白质：,清蛋白,球蛋白,醇溶蛋白,谷蛋白,3-4%31%38%29%,3.,发酵产品中氮的含量也是一个产品指标，如酱油中氮的含量是划分产品等级的重要指标，如氨基氮,0.8g/ml,为一般,0.6g/ml,为二级,0.4g/ml,为三级。酵母中氮的含量也是一重要指标。,4.,在发酵工艺过程中，蛋白质及其分解产物对产品的色香味和产品质量都有一定影响。,根据蛋白质的性质和成分测定蛋白质的方法分为两大类,：,一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率测定蛋白质含量,另一类是利用蛋白中特定氨基酸残基和芳香基团测定蛋白质含量,在发酵产品及发酵原料中，可能包括非蛋白质氮的化合物如：核酸、含氮碳水化合物、生物碱、含氮类脂、和含氮的色素，通常凯氏定氮法测定总氮量，再乘以,6.25,就是蛋白质的含量，因此包括非蛋白质部分，称为粗蛋白质。,（,2,）,测定蛋白质的方法,凯式定氮法（,Kjeldahl,）,水杨酸比色法,：,其他方法,1,2,3,凯式定氮法,-,原理,将试样与硫酸一同加热消化，硫酸使有机物脱水，破坏有机物，有机物中的碳将,H,2,SO,4,还原为,SO,2,，本身和氢氧化为二氧化碳和水逸出，而蛋白质分解氨，则与硫酸化合成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨脱离，用标准酸接收，过量酸用标准碱滴定。,其反应式如下：,消化：,2H,2,SO,4,2SO,2,+2H,2,O+O,2,（硫酸）,C+O,2,CO,2,2H,2,+O,2,2H,2,O,硫酸铜催化,2NH,3,+H2SO,4,(NH,4,),2,SO,4,2CuSO,4,Cu,2,SO4+SO,2,+O,2,C+O,2,CO,2,2H,2,+O,2,2H,2,O,CuSO,4,+2H,2,SO,4,2 CuSO,4,+SO,2,+2 H,2,O,凯式定氮法,-,原理,在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物的分解，氨与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点,330,，而添加硫酸钾后，温度达到,400,，加速了整个反应过程。此外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点。随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。加速了有机物的分解。,其反应式如下：,K,2,SO,4,+H,2,SO,4,=2KHSO,4,2KHSO,4,=K,2,SO,4,+H,2,O+SO,3,但硫酸钾的加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。,(NH,4,),2,SO,4,NH,3,+(NH,4,)HSO,4,2(NH,4,)HSO,4,2NH,3,+2SO,3,+2H,2,O,所以有机物全部消化后，呈现硫酸铜的蓝绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。,凯式定氮法,-,原理,蒸馏,：样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这个操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。,其反应式如下：,2(NH,4,),2,SO,4,+2NaOH,2NH,4,OH+Na,2,SO,4,NH,4,OH,NH,3,+H,2,O,吸收与滴定,：蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液。这样便可以计算出总氮量。,2NH,3,+H,2,SO4,(NH,4,),2,SO,4,蒸馏出的氨被硫酸吸收,H,2,SO,4,+2NaOH,2H,2,O+Na,2,SO,4,过量的硫酸用氢氧化钠滴定,半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸溶液直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不仅影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。,其反应式如下：,2NH,3,+4H,3,BO,3,(NH,4,),2,B,4,O,7,+5H,2,O,(NH,4,),2,B,4,O,7,+2HCl+5H,2,O,2NH,4,Cl+4H,3,BO,3,凯式定氮法,-,计算,式中：,(NV),H2SO4,-,接收瓶中,H2SO4,溶液的当量浓度与体积（,mL,）,(NV),NaOH,-,滴定时消耗,NaOH,溶液的当量浓度与体积（,mL,）,0.01401-,氮的毫克当量（,g,）,W,试样重量（,g,）,粗蛋白质（,%,）,=6.25,总氮量（,%,）,一般成品与原料,K=6.25,（蛋白质含氮量,16%,）,小麦粉,K=5.7,（,N17.6%,）,乳制品,K=6.38,（,N15.7%,）,动物胶,K=5.58,（,N18.0%,）,大豆制品,K=6.0,（,N16.7%,）,凯氏常量定氮法：,式中：,N,标准酸溶液的当量浓度,V1,空白滴定消耗标准酸溶液的量（,mL,）,V2,样液滴定消耗标准酸溶液的量（,mL,）,W,样品重量（,g,）,0.01401:,氮的毫克当量数,凯氏半微量定氮法：总氮量（,%,）,=,凯氏微量定氮法：,凯氏自助定氮仪法：,凯氏自助定氮仪,:,具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置及自动数字显示装置,消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶以及红外线装置的消化炉。,1h,内，同时可以测定,8,个样品。,说明：,1.,常量法可测定范围约,40mg,氮,2.,水蒸气蒸馏半微量法可测定,16mg,氮，微量法可,测定至,0.05-0.3mg,氮。,水杨酸比色法,（,1,）原理,：,样品中的蛋白质经硫酸消化转化铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与水杨酸钠和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物，可以在波长,660nm,处比色测定，求出样品含氮量，计算出蛋白质含量,。,（,2,）,操作：,1.,标准曲线绘制,2.,样品处理,3.,样品测定，比色,水杨酸比色法,（,3,）计算,C,从标准曲线中查出测定样液的含氮量（,g,）,F,样品溶液的稀释倍数,W,样品重量,蛋白质（,%,）,=,总氮,%,K,（,k,值与凯氏定氮法同）,说明：,1.,试样为谷物和饲料中的蛋白质,2.,样品消化后当天测定，结果重现性好,3.,颜色的显色与温度有关，应严格控制反应温度,其他方法,皮尼克法（双缩脲反应）,（,1,）原理：双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜结合成紫红色络合物。蛋白质分子中含有的肽键与双缩脲结构相似，也呈次反应。,本法直接用于测定像小麦粉等固体试料的蛋白质含量。但作为铜的稳定剂，酒石酸钾钠比甘油好些，小麦粉中的蛋白质能直接地进行定量。,（,2,）操作：样品,+,试剂,离心分离,比色,凯氏定氮的样品中蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制曲线,（,3,）计算：,其他方法,（二）紫外分光光度法,原理：蛋白质及其降解产物的芳香环残基在紫外区内对某一波长具有一定的光选择吸收。在次波长下（,280nm,），光吸收与蛋白质的浓度（,3-8mg/ml,）成直线关系，因此，通过测定蛋白质溶液的吸光度，并参照事先用凯氏定氮法分析的标准样品，从标准曲线查处蛋白质的含量。,操作：样品,+,柠檬酸（,0.1mol/l,）,搅拌,离心,比色,计算：,说明：,1.,本法适用于牛乳和可溶性蛋白质样品,2,温度对蛋白质水解有影响，操作温度应控制在,20-30,2,氨基酸总量测定,甲醛滴定法,茚三酮比色法,范氏气体法,蛋白质区分（龙丁区分）,4,1,2,3,（,1,）,甲醛滴定法,原理：,氨基酸具有酸性的,-COOH,基和碱性的,-NH,2,基。它们相互作用使氨基成为中性的内盐。加入甲醛溶液时，,-NH,2,基与甲醛结合，其碱性消失。这样就可能用碱来滴定,-COOH,基，并用间接的方法测定氨基酸的量。反应式如下：,（,1,）,甲醛滴定法,计算氨基酸根据,NaOH,的消耗量来计算。,根据以上原理，一分子,-COOH,，一分子,-NH,2,，只能在中性氨基酸情况下，得到的结果是对的，但在理论上解释是不通的。,假如说：酸性氨基酸：谷氨酸（,2,个,-COOH,，,1,个,-NH,2,）使数值偏高。,碱性氨基酸：赖氨酸（,1,个,-COOH,，,2,个,-NH,2,）使数值偏低。,但在实际结果是对的，为什么在理论上讲不通？,一种解释是这种理论是解释不清的。,另一种解释是加甲醛是降低物质的负电性。,（,1,）,甲醛滴定法,问：为什么是,pH8.2,和,pH9.2,？,答：人为规定是因为甲醛法中除氨基氮外别的氮也能起反应，故误差较大，另外由于各种氨基酸的等电点不同，故必须确定，一个合适的滴定终点，酱油中有多种氨基酸，照理有多种等电点，故碱中和一般在,8.2,左右，将,pH9.2,作为系统等电点，规定好以后，大家都是这样做的,（,1,）,甲醛滴定法,计算：,式中：,NNaOH,标准溶液的当量浓度,V-,加甲醛后试液消耗,NaOH,溶液体积（,mL,）,V,0,甲醛后空白液消耗,NaOH,溶液体积（,mL,）,0.01401,氮的毫克当量（,g,）,10,吸取酱油的体积（,mL,）,说明：在用甲醛法测定时应注意：,空气中,NH,3,存在干扰,消耗甲醛，消耗,NaOH,（放出,H,+,）可加,Mg(OH)2,，煮沸除去。,碳酸盐，磷酸盐有干扰，可加,Ba(OH)2,除去,Na,2,CO,3,K,2,PO,3,（,2,）茚三酮比色法,原理：氨基酸在一定的,pH,条件下，与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量，反应式如下：,计算,式中：,C,标准曲线上差得的氨基酸数量（,g,）,W-,测定的样品溶液相当于样品的量（,g,）,比色法要注意的：,用比色计非常灵敏，容器内壁不能用手接触（以防手上的微量氨基酸进去）,（,3,）范氏气体法,原理：氨基酸与亚硝酸作用生成羟基酸而析出氮，析出的氮分子（,N2,）氨基酸只占一个氮原子，另一个氮原子来自亚硝酸，借测定氮的体积计算氨基酸的含量。,亚硝酸是由亚硝酸钠与冰乙酸作用生成，亚硝酸很易分解并产生氮的氧化物而影响氮的体积测定,（,3,）范氏气体法,NaNO,2,+HAc,NaAc+HNO,2,3 HNO,2,HNO,3,+2NO,+H,2,O,产生的一氧化氮与氮同时逸出，须用碱性高锰酸钾完全吸收下才能测量氨基酸的体积。,NO+KMnO,4,(,碱性,),KN0,3,+MnO,2,或,NO+3KMnO,4,+4KOH,KNO,3,+3K,2,MnO,4,+2H,2,O,在,量,氮计内所读取的氮体积数，是住在实验室的温度和气压下的体积，应换算成标准状况下的体积，并根据摩尔体积关系进行计算,.,用此方法测定氨基酸的量比较准确，因此,NH2,（氨基）里放出,N2,比较准。但操作手续麻烦，须用专门仪器。,(4),蛋白质区分（龙丁区分）,在啤酒酿造中通过酶的作用，蛋白质逐步降解为膘，胨，肽，氨基酸，啤酒质量不仅与总蛋白质有关，并且与分解产物各种百分含量有关。,总蛋白质的量够了，并不等于一定生产出好的产品，好产品与各种蛋白质百分含量有关（或者说，有一个恰当的高，中，低蛋白质的比例）,按分子量大小，将这些降解产物划分为若干部分，即所谓蛋白质的区分，蛋白质在麦芽汁和啤酒中的状况，主要取决于发芽过程中，它直接影响到啤酒的保存性和泡沫性以及啤酒的感官特性。,(4),蛋白质区分（龙丁区分）,龙丁区分法,它是以草酸和钼酸钠两种沉淀剂蛋白质降解物分成三个区分。,高分子蛋白质,膘多，,A,区，分子量在,60000,以上,中分子蛋白质,胨多，,B,区，分子量在,12000-60000,之间,低分子蛋白质,氨基酸多,C,区，分子量在,12000,以下,磷钼酸,高分子蛋白质,单宁酸,清液,-,中，低分子测定,-,清液,-,低分子氮,中分子蛋白质,沉淀,高分子,沉淀,-,高分子氮,低分子蛋白质,测定中：,N,总,-N,中、低,=N,高,N,总,-N,高,-N,低,=N,中,(4),蛋白质区分（龙丁区分）,啤酒中含氮比例,一般啤酒,高分子氮,25%,非生物沉淀,中分子氮,15%,泡沫稳定性差（泡持性）,低分子氮,60%,以上口味淡薄,低分子过多或过少，会造成酵母早衰,过多，酵母长得太好，不产啤酒,过少，酵母长得不好，也产不出啤酒,正常的啤酒中蛋白质含量在,0.5%,以下，实际浸出物中蛋白质占,6.259.4%,适宜的蛋白质区分为,A,区,15%,以上，,B,区,25%,，,C,区,60%,可溶性氮,%,，总氮,%,。此值越高，溶解越好，,经验值为：,41%,优,35%-38%,一般,38%-41%,良,35%,以下,差,第四节 酸度的测定,1,测定酸度的意义和方法,2,总酸的测定,3,挥发酸的测定,5,酸度与,pH,之间的关系,4,有效酸度（,pH,值）的测定,一、测定酸度的意义和方法,酸的测定不仅对微生物发酵过程中具有一定的指导意义，而且酸对发酵产品的质量关系甚大。如酒和酒精的生产中，对麦芽汁，发酵液，酒醅，固体曲，酒母醪等中的酸都有一定的要求。发酵制品如白酒，啤酒，酱油，食醋等中的酸又不是一个重要的质量指标。它影响产品的香味，颜色，稳定性和质量的好坏。,1,、酸的来源,1,）微生物代谢诶产生的酸,2,）原料中带来，如葡萄中存在酒石酸钾,3,）工艺中加进去，如调,pH,人工加进去,测定酸度，特别对微生物污染是有效的测定方法，如啤酒中乳酸含量高时，则说明啤酒已被乳酸污染。白酒中含量在,0.1%,以上醋酸则说明酒醅已染菌。,一、测定酸度的意义和方法,2,、发酵酸度的特点,通常是一些有机酸：如醋酸（乙酸），草酸，乳酸，柠檬酸，酒石,酸，琥珀酸，苹果酸,挥发酸,甲酸，乙酸，丁酸,非挥发性酸,乳酸，琥珀酸，柠檬酸,一般含量低,不是单一的，而是多种混合酸，因此等电点也是一个系统的等电点。,因有这,3,个特点，给分析带来了很多困难。,一、测定酸度的意义和方法,3,、,酸度的测定内容与方法,内容,：,1,）总酸度（可滴定酸度）,2,）有效酸度（氢离子？度，,pH,值）,3,）挥发酸（醋酸，蚁酸，丁酸）,总酸度：滴定前已离子化的，也包括滴定时产生的氢离子,有效酸度：人们味觉中的酸度，各种生物化学变化的动向和建议，主要不是取决于酸的总量，而是取决于离子状态的那部分酸。所以通常用氢离子活度（,pH,值）来表示有效的酸度,总挥发酸：游离的，蒸馏时易挥发,结合多，蒸馏时挥发比较困难,用蒸汽蒸馏并加入,10%,磷酸，可使结合状态的挥发性得以离析，并显著地加速挥发性酸的蒸馏过程。,方法,：中和法（总酸度）,点位滴定法（有效酸度，,pH,值）,比色法,一、测定酸度的意义和方法,4,酸度的表示方法,（,1,）常以样品中主要的酸来计算，如就中以乙酸计，食醋中非挥发酸以乳酸计，葡萄酒中以酒石酸计,（,2,）在特定的条件下，也可采用消耗氢氧化钠操作溶液，毫克当量数或体积数来表示。,二、总酸的测定,原理：总酸度是指所有酸性成分的总量。所以样品溶液用标准碱性溶液滴定时被中和生成盐类。用酚酞作指示剂时，它在约,pH8.2,就确定了游离酸中和的终点。如，无色酚酞与碱作用时生成酚酞盐，当,pH,升高时，酚酞先离解一个,H,+,形成无色离子。然后再离解第二个,H,+,并发生结构改变，同时失去,1,分子，引起了醌型重排而呈现红色，由消耗标准碱液的量就可以求出样品中酸的百分含量。其酚酞显色反应氏见如下：,二、总酸的测定,例：白酒的总酸度的测定,吸取,50mL,白酒,500mL,三角瓶,+100mL,水,+2D,酚酞,NaOH,微红,计算,NVNaOH,溶液的当量浓度与消耗的体积（,mL,）,0.06006,乙酸的毫克当量（,g,）,50,吸取酒样的体积（,mL,）,100,换算成,100mL,酒样中酸量,若以乳酸计，则将乙酸的毫克当量换成乳酸的毫克当量（,0.09008,）。说明：样品的颜色过深，可加入等量蒸馏水再滴定，也可用点位或电导？法,三、挥发酸的测定,测定挥发酸：方法有直接法和间接法。直接法用碱液滴定，由蒸馏或其他方法所得的挥发酸。间接法是将挥发酸蒸发除去后，滴定不挥发的残渣的酸度，再由总酸度减去此残渣度即得挥发酸含量。一般以直接法较为便利。,1,原理：挥发酸可用水蒸气蒸馏使之分离，挥发酸经冷凝收集后，可用标准碱液滴定，反应式如总酸度测定。,2,操作：,100mL,酒样,+100mL,水接收,100mL,取,25 mL,2,滴酚酞用,NaOH,滴定,+150mL,三角瓶微红,3,计算：,非挥发性酸（以乳酸计,g/100mL,）,=,总酸（以乳酸计,g/100mL,）,-,挥发性（以乳酸计,g/100mL,）,本方法也适用于葡萄酒，黄酒，酒精，食醋以及发酵醪中总酸，挥发酸，非挥发性酸的测定。,四、有效酸度（,pH,值）的测定,原理：,pH,值是氢离子浓度的负电数。,pH,值,=-logH+=1/logH+,。,20,的中性水，其离子积为,H+H-=10,-14,.pOH=14.,因此，在酸性溶液中,pH7,而在碱性溶液中,Ph7,。中性溶液,pH,值为,7.,点位分析法,测定电池两极同一电位差或电位差的变化为基础的分析方法。,测定,pH,值的方法有,pH,试纸法，标准色管比色法和,pH,计测定法。前两者都是用不同指示剂的混合物显示各种不同的颜色来指示溶液的,pH,值。,pH,试纸市场有出售。,pH,计实际上是电化学法的一种，它由一支能指示溶液,pH,法的玻璃电极作指示电极，另用甘汞电极作参比电极组成一个电池。他们在溶液中产生一个电功势，其大小与溶液中的氢离子浓度有直接关系。其方程式,E=E0+0.0591logH+=E0-0.0591pH.,即每相差一个,pH,值单位就产生,59.1mV,的电极电位，就可以在,pH,计表头上读出样品溶液的,pH,值。,四、有效酸度（,pH,值）的测定,1,）,先用标准,pH,溶液进行校正，定好后，校正旋钮不能移动了。,2,）,玻璃电极提前,24,小时进