新版体内药物分析.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文章内容来源于网络，如果侵权或者不当的地方，请联系我删除或者改正。文章内容仅可参考，不能作为科学依据。谢谢！,The content of this article comes from the Internet.If there is any infringement or improper place,please contact me to delete or correct it.The content of the article can only be referred to,not as a scientific basis.thank you!,第一篇 总论,1.体内药物分析:,药物分析的的重要分支，是研究,生物体中,药物及其代谢物和内源性物质质与量变化规律的分析方法学。,2.体内药物存在形式:,药物进入体内后，经过吸收、分布、代谢和排泄过程，其化学结构与存在状态发生变化。其存在形式有四种。,3.体内药物分析特点:,药物浓度低、干扰多。除了少数情况，在最后进样之前都要采取适当的,样品制备,。样品制备是重要步骤，采用高灵敏度、高专属性分析方法是关键。,第一章 绪论,第一节 体内药物分析意义、性质、对象和任务,一、体内药物分析的,意义,以往：,药物质量的认识和控制只重视药物的鉴别、检查、,含量等。,当今：,药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程与药物,疗效关系的进一步认识。,发现化学等价而生物学不等价。,二、体内药物分析的,性质,1.药物临床前研究,2.临床试验,3.使用,4.药物作用机制的探讨,5.药物质量的评价,6.用药规律,7.安全、有效、合理用药,8.保障人类健康长寿,（一）,对象,动物和人,（二）任务,1.方法学研究：,提供合理的、最佳的分析条件；评价分析方法的灵敏度、专属性、准确度、精密度等；各种分析方法的关系。,2.为药物体内研究提供数据,3.为临床治疗药物检测提供准确的血药浓度测定值,4.内源性物质的测定和研究：,激素、儿茶酚胺、尿素,5.滥用药物的检测：,麻醉、精神药品、运动员应用兴奋剂等,三、体内药物分析的,对象和任务,第二节 体内药物分析的特点与要求,一.体内药物分析的,特点,1.干扰杂质多,2.样品量少在特定条件下采集，不易重新获得,3.分析方法的的灵敏度和专属性要求高,4.药物浓度低，有时需测代谢物,5.测定方法有时要求简便、快速，以便为临床用药及中毒,解救提供数据和情报,6.实验室应具有多种项目分析的设备和能力,7.工作量大，数据量大，结果分析复杂,二.分析方法的,要求,1.高灵敏度的检测方法,2.建立高选择性、高专属性的分离方法,3.达到方法学要求的精密度、准确度，且,有稳定而高的回收率,4.求解出有意义的参数,第三节 发展概况和学科热点问题,一.发展概况,临床药理学和生物药剂学,二.学科热点问题,1.游离型血药浓度测定方法研究,2.血药浓度,游离型药物浓度,（F）与总浓度（T）的比率（F/T）、,唾液药物浓度,（S）与血液药物浓度（P）比率，以及它们之间相关性的研究,3.代谢物的检测与研究,4.对应体的检测与研究,5.体内微量元素的检测与研究,6.方便、快捷的样品制备与样品直接进样分析研究,7.分析新方法、新技术的联用研究,8.体内药物分析方法质量控制研究,第二章 体内药物分析的相关基础理论概述,第一节 药物体内过程,一.药物的,吸收,：,1.给药途径：,血管内和血管外,2.药物吸收的影响因素,（1）药物的理化性质：,脂溶性、解离度,（2）药物的转运类型,（3）药物的剂型,（4）吸收部位的血流状况,（5）给药途经,3.药物吸收的部位,1）胃肠吸收,（1）胃吸收,A:崩解后溶于胃酸才能吸收,B:胃酸pH低，有机弱酸性药物易在胃中吸收,C:pKa相近的情况下，分子状态药物中脂溶性大者吸收快,D:药物在胃内滞留时间短，吸收有限,E:有些药物胃刺激性大，胃内易分解,（2）小肠吸收,A:,药物在小肠停留时间长，小肠吸收面积大，为药物主要,吸收部位。,B:,有机弱碱性药物易在小肠中吸收,C:,肠溶片、肠溶胶囊到达肠道后崩解、溶解、吸收，避免,了药物的胃刺激,（3）胃肠吸收的影响因素,A:剂型及理化特性,B:食物（延缓药物的吸收，不影响最终吸收总量）,C:胃肠道的功能,D:药物的,首关效应,E:药物的相互作用,2）注射部位的吸收,（1）优点,A:适于胃肠中易降解的药物,B:大量而迅速地在肝脏首过代谢的药物,C:促进药物的药理作用尽快发生,D:保证患者用药的依从性,（2）特点,A:,脂溶性药物必须有一定的水用性,B:,脂溶性药物对其跨膜转运有帮助,C:,注射部位血液循环状态影响药物吸收,D:,不同的肌肉群吸收药物的速度不同,3）黏膜与皮肤吸收,（1）黏膜吸收,A:药物吸收量少，主要发挥局部作用,B:适合首过效应显著的药物,（2）,皮肤吸收,A:脂溶性药物易自皮肤吸收,B:炎症、创伤性皮肤和单薄,部位的皮肤易于药物吸收,C:除产生局部作用外，有些,药物也能产生全身作用,4）其他部位的吸收,（1）直肠给药的吸收,A:,防止药物对消化道的刺激,B:,直肠给药不能避免首过效应,C:,直肠给药通常为液体制剂或,栓剂,D:,吸收表面积小，吸收的量,小，不规则,（2）,肺部药物的吸收,A:挥发性、气体性药物亦被动扩散的方式吸收,B:颗粒越小吸收越快，大于20m易在支气管沉,积，小于1m颗粒直接达到肺泡吸收,C:适合麻醉药和平喘药,二.药物的,分布：,1.药物分布的影响因素,（1）药物的化学结构与理化性质,A:有机弱酸性药物分布细胞外液（pH7.4）,B:有机弱碱性药物分布细胞内液（pH7.0）,C:蛋白结合率高的药物主要分布于细胞外液,D:游离型、未解离的脂溶性药物分布于细胞内,E:能与细胞内组分结合的药物分布于细胞内,（2）血流量与膜通透性,A:灌注速度,（每分钟通过单位容积组织的血液毫升数）,组织灌注速度差异大（10-0.02ml/min），药物在血流丰富的组织的分布比血流少的组织迅速。,B:膜的通透性,药物穿越的屏障可为单层的细胞，也可为数层细胞。小分子药物（100-200）外，大多数药物不能通过细胞间隙转运，而以一定的,转运机制通过细胞,。,（3）体内的特殊屏障,A:血脑屏障,缺少细胞间隙孔道，缺少具有吞噬功能的的囊泡，全部由,星形胶质细胞,包围。是由,毛细血管壁,和,神经间质细胞,形成,的屏障。药物转运以被动扩散,为主，高解离度、非脂溶性、,蛋白结合率高的药物难于进入,脑组织。反之易进入脑组织。,炎性病变可以改变其通透性。,B:胎盘屏障,药物转运以被动扩散为主,母体中的药物多数能通过胎盘屏障进入胎儿体内,脂溶性药物易通过胎盘,分子量大小,影响胎盘转运的因素,注意药物的致畸作用,（4）药物与蛋白结合,（药物的体内过程示意图）,A:游离型与结合型药物,药物和蛋白结合是可逆的平衡,血浆蛋白：白蛋白、a-酸性糖蛋白、脂蛋白,药物总浓度（,C,t,）,药物的血浆蛋白结合率,药物与蛋白结合是以非共价键的形式,B:蛋白结合的影响因素,药物的浓度和蛋白的含量,药物与蛋白结合点的的亲和力,蛋白结合位点的数目,C:竞争性血浆蛋白结合,血浆蛋白结合率是新药审批时必须申报的研究资料,药物在蛋白同一结合位点的结合是非选择性的,理化性质相近的药物可竞争性的结合相同的位点,被置换下来的药物的游离浓度显著增高,有意义的情况是被置换,药物蛋白结合率,大于90%,三.药物的,生物转化：,1.药物代谢的反应类型及过程,（1）药物代谢的化学途径及部位,A:主要在肝脏进行,B:血液、胃肠道、肺、皮肤、肾脏等也发生,C:亚细胞水平：药物代谢酶位于内质网、微粒体、胞液等内,D:最重要的药物代谢酶为微粒体混合功能氧化酶系统,E:许多药物均可通过细胞色素P450系统氧化,（1）药物代谢的反应类型及特征,A:药物代谢反应,相反应、相反应,B:氧化反应,常见的碳原子氧化,C:还原反应,分子中的酮基被还原成醇基,D:水解反应,酯酶和酰胺酶水化和分解酯类和酰类化合物,E:结合反应,药物经过相反应，分子中增加了极性基团，,然后再发生相反应，从尿液中排出。,F:相反应的结合剂,葡萄糖醛酸等,G:乙酰化反应,类似于结合反应，是异烟肼、磺胺类等代谢,的主要途径，是一种特殊的代谢形式，代谢物的,极性,低于,母体药物,（2）药物代谢产物的药理活性,A:代谢产物失去药理活性,B:原来无活性转化成有活性,C:药理作用类型发生改变,D:产生有毒性物质,（3）影响药物代谢产物的因素,A:药物代谢的个体差异,不同种族之间；遗传因素（多态,性，快代谢和慢代谢）；环境因素,B:年龄和性别对药物代谢的影响,C:药物相互作用对药物代谢的影响,主要表现在肝药酶的诱,导和抑制作用,D:疾病对药物代谢的影响,三.药物的,排泄：,器官（肾脏、肝胆、肠道等）。,1.肾排泄,肾脏是排泄药物和代谢物的重要器官。药物的排泄率=肾小球滤过率+肾小管分泌率-肾小管重吸收率,（1）肾小球滤过,A:临床以内源性肌酐清除率为肾小球滤过率指标125ml/min。,B:肾小球滤过率代表肾功能,C:能滤过游离型药物或代谢物，结合型药物不能滤过,（2）肾小管的主动分泌,A:主动转运过程,B:分泌机制相同的两类药物合,用，竞争性抑制药物分泌,C:药物的排泄率大于滤过率，,肾小管主动分泌参与药物代谢,（3）肾小管的重吸收,A:药物的排泄率小于肾小球滤过率，肾小管重吸收,B:主动重吸收 将肾小管内溶质主动转运到肾小管外的组织,C:被动重吸收,2.胆汁排泄,是排泄药物消除的另一重要途径。原型药物的,排泄较少，代谢物排泄多。,A:水溶性大的药物和代谢物易通过,此途径排泄,B:血药浓度与胆汁药浓度相等为被,动排泄,C:血药浓度低于胆汁药浓度主动排泄,D:胆清除率=胆汁流量X胆汁浓度/血,浆药物浓度,E:但药物排泄具有肠肝循环特点,3.其他排泄途径,呼吸道、外分泌腺等,A:挥发性和醇类药物可经非呼出排泄，次要,B:乳汁药物排泄注意对新生儿的影响,C:影响药物乳汁分泌的因素,母体血浆稳态浓度,药物分子量大小,药物血浆蛋白结合率,药物的脂溶性,第二节 血药浓度与临床效应的关系,一.药物效应的个体差异,1.药效学及其与血药浓度的关系,A:药效学是研究药物对机体作用的性质、作用的机制以,及药物作用的“量”的规律的科学。,B:血药浓度的变化与药理作用的“量”有密切关系,（1）时效关系和时效曲线,时-效关系：,用药之后随着时间的推移，药物作用动态变化,的过程。,时-效曲线：,时间为纵坐标，药物作用强度为横坐标作图,A:起效时间,B:最大效应时间,C:疗效维持时间,D:作用残留时间,（2）时效曲线与血浆药-时曲线,药-时曲线：,药物浓度-药物效应曲线：,A:最小有效血浓度,B:最大效应血浓度,C:疗效维持血浓度范围,D:作用维持时间,E:有效血药浓度范围,F:特殊情况,代谢物发挥药理作用；药物浓度增高药效不增高等；代谢产物T1/2较长，且有活性，原形药物浓度降低，仍保持药理作用,（3）药物蓄积、作用蓄积和中毒反应,药物蓄积：,在前次给药的体内药物尚未完全消除之前第,二次给药，会产生体内药物蓄积。,作用蓄积,：,在前次给药的“作用残留时间”内第二次给,药，会产生药物作用蓄积。,中毒反应：,药物蓄积或作用蓄积达到一定程度就会产生,毒性反应,2.药物临床效应的个体差异,A:药物方面,B:机体方面,C:遗传方面,D:环境方面,二.游离型药物浓度与药效的关系,目前，血药浓度及药动学研究都是通过测定总浓度，一,般总浓度能反映药效，有时不能反映药效。,A:与血浆蛋白有高亲和力的，血浆蛋白结合呈明显的浓度,依赖性，可导致游离形药物的非线性药代动力学。,B:疾病,（肝、肾疾病）,改变药物与血浆蛋白的结合率,D:有些药物血浆蛋白结合率存在这个体差异,E:药物作用强弱与细胞外液浓度相关，细胞外液浓度与血,液浓度相关,三.活性代谢物与药效的关系,A:许多药物在体内形成具药理活性的代谢产物,B:全部的药效和毒性均有特定的代谢物产生时，应阐明药,理效应与代谢物浓度之间的关系,C:原形药物和代谢物均有药理活性,效应可能是两者相加也,可能是更复杂的关系,四.有效血药浓度范围,有效血药浓度范围是一个统计结论，对绝大多数患者适,用，应具体情况具体分析,A:患者的病理生理、年龄、联合用药等判断,B:药物治疗几种疾病，有效血药浓度会随病种改变,C:病人间存在着显著的个体差异，可能表现在疗效和毒,性反应中,地高辛 有效浓度范围：0.8-2.2ng/ml（与年龄和疾病相关）,第三节 血药浓度与合理用药,一.与血药浓度相关的药代动力学参数,1.药-时曲线,反映了药物的吸收、分布、代谢、排泄过程,2.药-时曲线下面积（AUC）,反映药物吸收的总量和程度,3.峰值血药浓度（Cmax）,常用于阐述血药浓度与毒性反,应关系,4.达峰浓度时间（Tmax）,机体对药物的吸收快慢,5.生物利用度（f）,是药物吸收速度和程度的量度,6.表观分布容积（Vd）,t时体内药物总量与血药浓度的比值,Vd=Dt/Ct，用于推测药物在体内分布的广泛程度和组织对药,物的摄取量。2.5-36L组织分布少；=36L均匀；36L分布强,7.半衰期（T,1/2,）,药物消除一半需要的时间（T,1/2ke,、T,1/2,）,是判断药物在体内残留的重要参数,8.稳态血药浓度（Css）,以一定的时间间隔，用相同的剂量,给药，则血药浓度叠加，当药物的吸收速率与消除速率相等,时，血药浓度在一定水平波动。,Css,max,；Css,min,二.根据T,1/2,确定给药次数,1.超快速消除类药物（T,1/2,1h）,药物的吸收、消除快,不宜在体内蓄积。日多次给药,2.快速消除类药物（T,1/2,=1-4h）,药物的吸收和消除偏快,往往忽视体内蓄积。长期使用毒性增加,3.中速消除类药物（T,1/2,=4-8h）,3-4次/日,4.慢速消除类药物（T,1/2,=8-12h）,2-3次/日,5.超慢速消除类药物（T,1/2,=12-24h）,1次/日或1次/隔日,6.非线性药代动力学类药物,血药浓度检测确定给药剂量,7.T,1/2,和抗菌药物后效应（PAE）与临常用药间隔,抗菌药,物的T,1/2,短，2-3次/日。对PAE认识，给要间隔根据MIC、,MBC、PAE综合,8.通过T,1/2,估算体内药物浓度,A:一次用药或长期用药后停药5个半衰期消除97%,B:连续用药5个半衰期，血药浓度达稳态，这时可检测血药,浓度,第四节 血药浓度测定种类,一.游离型和结合型药物总浓度测定,二.游离型药物浓度测定,1.药物和血浆蛋白结合率80%,2.药物治疗指数窄,3.游离药物血浆浓度受生理和病理影响大,4.,药物的分布容积2L,5.游离血药浓度与药理作用密切相关,6.符合条件的药物,抗癫痫药、抗心律失常药,7.游离药物的测定方法,A:平衡透析法 B:超滤法,三.药物活性代谢物的测定,1.建立方法时要考虑原形药物的干扰,2.代谢物的对照品难得到,四.对映体药物的测定,1.HPLC法应用广泛，技术成熟,2.立体异构药物药效学、药代动力学有差异,3.新药申报要求有对映体的各自药理作用、毒副反,应等报告,第三章 生物样品与样品制备,第一节 生物样品的种类、采集、制备与贮存,一.生物样品的种类、采集和制备,1.血液：,血浆、血清和全血,1）血样的采集,A:药物在血液中分布均匀后采样,B:从静脉、动脉和心脏（动物），常用的是静脉采血,C:1-5ml，动物10min；可用物理和化,学方法刺激采集,C:刺激法采集优点,缩短采集时间；减少pH（7.0）范围；药,物浓度个体差异小,D:唾液样品的制备,放置分层后，3000r/min离心10min,取上,清作为药物浓度测定样品,E:唾液采集特点,无痛、简便、经济等成为TDM的研究热点,4.组织,1）匀浆化法,A:组织检材中加入一定量的水或缓冲液，在刀片式匀浆机中,匀浆，取上清液供萃取,B:方法简便，回收率低,2）沉淀蛋白法,A:在组织匀浆中加入蛋白沉淀剂，取上清供萃取,B:方法简便，回收率低,C:常被采用，加入蛋白后上清液清澈，不乳化，杂质少,3）酸碱水解法,A:组织匀浆中加酸或碱，水浴加热，过滤或离心，上清萃取,B:适合热酸或热碱稳定的药物,4）酶水解法,A:在组织匀浆中加入酶和缓冲液，水浴，过滤或离心，取上清,液萃取,B:酶为蛋白水解酶的枯草菌溶素，可使组织溶解、药物析出,C:优点,可显著改善与蛋白结合紧密的药物的回收率；无乳化,化现象；可避免在酸和热下药物分解；采用HPLC法无需过多,净化,5.头发,A:用于体内微量元素测定,B:可用于用药史的估计,C:毒性药物的检测,6.其他体液,1）乳汁,用市售的吸乳器，取乳汁，3000r/min离心，取上清,供萃取,2）精液,近年有关精液中药物浓度的报道，甚少。,二.生物样本的贮存处理,1.冷藏与冷冻,生物样品量大，需要将其贮存。冷藏4C，冷,冻-20C,1）血液和血清样品,采血后及时分离，不超2h，分离后冷藏,4C或冷冻-20C,2）尿液样品,应立即测定，不能，应加防腐剂后置冰箱冷藏,4C或冷冻-20C,3）唾液样品,A:须测唾液pH值时，应取样后立即测定,B:冷冻的样品，须解冻后测定，解冻的样品应一次性测完,C:冷冻的样品，须解冻后充分搅拌，测定,2.去活法,1）为防止采样后酶对样品成分进一步分解，需要立即终止酶,的活性,2）常用的方法,A:液氮中快速冷冻,B:微波照射样品,C:抗氧化剂,D:酶活性阻断剂（三氯醋酸）,E:匀浆和沉淀,F:样品煮沸,第二节 生物样品的预处理和制备,一 生物样品预处理的目的,1.使药物从缀合物及结合物中释放出来，测定其总浓度,2.生物样品成分复杂、干扰多、含量低。经预处理达到纯,化、富集等目的,3.为了适应和符合测定方法的灵敏度,A:免疫分析法可不作预处理,B:紫外、荧光分析法样品预处理十分必要,4.为了防止分析仪器的污染、劣化，提高灵敏度、准确性、精密度和选择性,A:生物样本中的脂肪、蛋白、不溶性颗粒等杂质污染仪器,B:生物样本可根据仪器的不同而不同,如HPLC法,二.样品制备时应考虑的问题,1.药物的理化性质和存在形式,A:药物的酸碱性、未电离分子的亲脂性、挥发性,B:药物光谱性及官能团,C:药物在体内的存在形式及蛋白结合率,2.待测样品的浓度范围,A:生物样本中药物浓度个体差异大 地高辛1-2ng/ml；水杨酸,盐20-100,g/ml,。,B:浓度高的对样品与处理要求低，低的要求高,3.药物测定的目,A:急性中毒病例,B:大部分的体内药物分析，均需要进行全面的样品与处理研究,4.选用的生物样本类型,A:血浆、血清出蛋白后处理,B:唾液通过离心除蛋白后萃取,C:尿液中的缀合物常用酸和酶法水解缀合物,D:头发需有机破坏,三.生物样品的预处理技术,A:有机破坏法,B:除蛋白法,C:分离、纯化与浓集,D:缀合物水解,E:化学衍生化法,1.有机破坏法,湿法破坏、干法破坏及氧瓶燃烧法,1）湿法破坏,A:硝酸-高氯酸,适于血、肝、尿液等破坏，测高价无机离子,B:电热消化法 人发的消化,C:电热板消化法 人发的消化,D:烘箱消化法,2）干法破坏,A:高温电阻炉灰法 人发的消化,B:低温等离子灰化法 人发的消化,3）氧瓶燃烧法,血样和人发的消化,2.去除蛋白,测定血样时首先除蛋白,A:可是结合型药物释放出来,B:减少提取过程中的发泡和乳化,C:保护仪器的性能，延长使用期,1）溶剂除蛋白,A:加入与水相混溶的溶剂,C:蛋白聚集，结合药物释放出,D:血样与溶剂体积比为1:3除90%,E:操作,混合、遥均、离心、吸上清,2）加入中性盐,A:中性盐能将蛋白水合的水置换出来，蛋白质脱水而沉淀,B:常用的盐,饱和硫酸铵等,C:操作,1:2混合、离心、取上清，除90%以上蛋白,3）加入强酸,A:加入强酸可与蛋白质阳离子形成不溶性的盐,B:常用的酸,10%三氯醋酸等,C:操作,1:0.6混合、离心、取上清，除90%以上,D:血含酸不稳定药物不宜,4）加入含锌或铜盐,A:金属离子和蛋白分子的的带阴电荷的基团形成不溶沉淀,B:常用的盐,ZnSO,4,-NaOH等,C:操作,1:（1-3）混合、离心、取上清，除90%以上蛋白,5）超滤法,A:超滤膜为分离介质的膜分离技术,B:膜孔径大小有区别,6）其他方法,A:酶水解法,B:加热法,3.分离、纯化与浓集,A:选择性分离是相当重要的，内源性物质、代谢物、其他共存,药物干扰分析结果,B:药物处理分为两部,样品的前处理和处理后的测定,C:前处理,出去介质中杂质提取出被测物，浓集被测物，达到,仪器要求的检测限，提高专属性,D:有的分析仪器具备提取、纯化、浓集、进样分析,1）液-液提取法,A:多数药物亲脂性的，杂质是亲水性，可用有机溶剂提取,B:选择溶剂考虑,了解药物与溶剂的化学结构,对药物未电离的分子可溶，电离分子不溶,溶剂沸点低，易挥发浓集,与水不相混溶,无毒，不易燃烧,不易形成乳化,具有较高化学稳定性和惰性,不影响检测,C:有机溶剂的体积,样品与提取溶剂体积比1:（1-2）,D:样品溶液的pH,碱性药物最佳pH要高于pK,a,1-2单位,酸性药物最佳pH要低于pK,a,1-2单位,原则是酸性药物在酸性，碱性药物在碱性环境提取,待测药物多为碱性的，内源杂质多为酸性的,对空白血pH13、7、2的HPLC法研究,E:如碱性药物在碱性条件下不稳定，在近中性pH提取,F:中性药物在pH7附近提取,G:一般只提取一次，有时需要多次提取和反复提取,H:优点和缺点,药物可与多数的内源性物质分离,有机溶剂可挥发达到浓集目的,易产生乳化，降低回收率,2）固相萃取（SPE）,将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品通过时，由于受到“吸附”或“分配”或“离子交换”或其他亲合力作用，药物或杂质被保留在柱上，用适当流动向洗去杂质，再用适当流动向洗脱药物,A:两种洗脱方式,药物比杂质与固定相之间亲和力强；杂质比药,物与固定相之间亲和力强,B:SPE构造,C:SPE固定相的选择,固定相与被测组分具有相似的极性,冲洗时改用与被测组分极性相近似的溶剂,D:SPE的种类,亲脂型,大孔吸附树脂；亲脂性键合相硅胶,亲水型,硅胶；硅藻土；棉纤维,离子交换型,E:亲脂性键合相硅胶,十八烷基键合相硅胶最常用；吸附非,极性药物，易于有机溶剂洗脱；常见商品,Sep-Pak C,18,亲脂性键合相硅胶SPE的操作,（1）甲醇湿润小柱，活化填料,（2）用水或缓冲盐冲洗小柱,（3）加样，样品和小柱接触，弃去废液,（4）用水或缓冲液冲洗小柱,（5）选择洗脱液洗脱，收集洗脱液,（6）用洗脱液测定或浓集,亲脂性键合相硅胶SPE注意,（1）体液样品可直接上样，体积0.1-2ml，流速1-2ml/min,（2）萃取碱性药物其中残存的羟基与药物的静电作用，甲醇,等很难洗脱，需加酸等,（3）苯基、氰基柱有一定极性，极性药物吸附力大，用极性,溶剂洗脱,亲脂性键合相硅胶SPE特点,（1）方便、省时,（2）洗脱溶剂量少,（3）用多个柱同时萃取,I:其他SPE小柱,（1）苯基硼酸键合硅胶,选择性的萃取血浆中,-拮抗剂,（2）环糊精键合硅胶,选择性的萃取磺胺类,（3）免疫亲和固定相,萃取生物大分子,G:离子交换树脂,（1）弱酸性药物,中性或碱性下，用阴离子交换树脂萃取，甲,醇清洗，酸性溶液洗脱,（2）碱性药物,方法相反,（3）适合高极性，可电离的药物，回收率90%以上,H:亲水型填料,填料硅胶、硅藻土、棉纤维,（1）为分配作用,（2）萃取,样品加到柱上，分布到填料表面，用水不容的有极,相洗脱亲脂性药物,F:大孔吸附树脂,（1）具有较大的表面积，适于吸附较大的分子,（2）传质速度快，有不同的极性,（3）使用前甲醇等除杂质，有时需用酸或碱处理,3）萃取方法的选择,（1）较亲脂的药物,A:溶剂提取,B:烷基键合硅胶SPE提取,C:大孔树脂SPE提取,D:亲水型填料SPE提取,E:烷基键合硅胶SPE提取最佳，碱性药物选大孔树脂SPE提取,（2）较亲水具有酸碱性、可解离药物,A:离子交换树脂SPE小柱,B:形成离子对络合物,（3）亲水不能电离药物,不易萃取，可用蛋白沉淀进样法,4）各种萃取方法的比较,（1）SPE的比较,A:离子交换SPE回收率及选择性高,B:亲脂性键合硅胶SPE常用,（2）SPE与LIE及沉淀蛋白法比较,A:SPE萃取试剂与样品接触面大，短时间达有效萃取，自动化,B:回收率及选择性因药而异，,SPE,与,LIE,无区别,C:蛋白沉淀法简便、回收率高，浓度低时不使用,5）SPE优缺点,（1）SPE优点,A:引入杂质少,B:避免乳化形成,C:在优化条件下有较高的回收率、重现性好,D:可用少量样本,（2）SPE缺点,A:价格贵,B:技术要求高,C:批与批之间有差异,3.自动化SPE技术,1）,自动化SPE技术,优缺点,A:节约时间，工作效率高,B:减少操作误差，提高准确度和精密度,C:安全，避免与有毒物接触,D:残留物对测定影响,E:采用连续进样时，要考虑测定物稳定性,2）,自动化SPE设备,A:在线技术,限制性介质填料；湍流色谱；在线固相萃取技术,B:独立工作站,C:96通道工作站,3）,自动化SPE方法的建立,A:柱预处理,除去填料杂质；填料溶剂化,B:加样,试样溶剂强度不宜过高，反向萃取水或缓冲为溶剂，,可加少量的有机溶剂,C:除去干扰杂质,中等强度的清洗剂洗干扰物，反向萃取用,水-有机溶剂（95:5）,也可加少量缓冲液。,D:分析物的洗脱和收集,重要，用水-有机溶剂（5:95）洗脱,E:收集的样直接进样，或浓集,4）其他,萃取技术,A:固相微萃取技术,B:膜萃及位微透析技术取技术,C:超临界流体萃取技术,4.化学衍生化,1）光谱技术,（1）紫外分光光度法,紫外没有吸收或吸收小的药物,（2）荧光光度法,不具天然荧光的药物,（3）色谱分析法,极性大、挥发性低、热不稳定、检测灵敏度不够,A:GC法中的化学衍生化法,使极性药物变成非极性的、易挥发,法的药物；增加药物稳定性；提高光学异构体的分离能力,主要衍生化反应,硅烷化：,R-OH；R-COOH；R-NH-R等极性基团药物,酰化：,R-OH；R-NH,2,；R-NH-R等极性基团药物,烷基化：,R-OH；R-COOH；R-NH-R等极性基团药物,生成非对应异构体衍生化法：,具有光学异构体的药,R（-）与,（+），,用不对称试剂使其生成非对应异构体衍生物，GC分析,B:HPLC法中的化学衍生化法,使极性药物变成非极性的、易挥,目的：,提高灵敏度；提高分离度,反应条件：,条件严格；对某样只生成一种衍生物，副产物不,干扰测定；衍生试剂易得，通用性好,种类：,柱前衍生；柱后后衍生,紫外衍生化反应：,紫外无吸收或吸收系数小，衍生化后有紫外,吸收,荧光衍生化反应：,无荧光，衍生化后有荧光，提高灵敏度,电化学衍生化：,灵敏度高；选择性强；有电化学活性药物是,指药物与某些试剂反应，生成电化学活性衍生物，电化学检测器检测。带有硝基的衍生化试剂与羟、氨、羧基等化合物反应可生成电化学活性衍生物,手性生化法：,用手性衍生化试剂将药物对映体转变成相应的非对映异构体，色谱检测,选择该方法的原因：,不宜直接拆分；添加基团，增加色谱系统的对映异构体的选择性；提高紫外或荧光的检测效果,满足的条件：,溶质分子至少有一个官能团供衍生；手性衍生化试剂达到对映体纯；反应条件温和、简便、完全；生成的非对映异构体应易被裂解为原来的对映体,第四章 体内药物分析方法的建立与验证,第一节 分析方法的设计依据,一.待测药物的理化性质及体内存在状况,1.待测药物的理化性质,1）待测药物的pKa值及其亲脂性、水和有机溶的分配系数,等决定萃取方法,2）药物挥发性判定是否GC检测,3）药物的紫外、荧光、电化学特性决定检测方法,4）药物酸碱、光、热的稳定性,2.待测药物的体内状况,1）蛋白结合强时，不宜用溶剂萃取,2）原形药物与代谢物共存时，分离度是否良好,3）药物浓度过低采用高灵敏度方法,2.分析测定的目的与要求,1）药代动力学研究,A:测定血中的药物和代谢物,B:要求较宽的线性范围（Cmax/Cmin,1/10-1/20,）,C:较高的灵敏度（10,-9,g/ml）、准确度,D:分离度大于1.5,E:常用的仪器HPLC、GC、LC-MS,2）血药浓度监测,A:要求线性在有效浓度范围内,B:分析方简便、易行、适用于长期和批量样品测定,C:常用的仪器TDX,3.生物样品的类型与样品制备方法,A:生物样品的类型与样品制备与分析方法与有密切关系,B:血浆血清，用蛋白沉淀-溶剂萃取技术，HPLC测定,C:用RIA时样品的预处理可粗放,4.试验室条件,A:试验室设备,B:试验人员,C:验室SOP,D:分析软件,第二节 分析方法建立的步骤,一.分析方法的选择,A:样品中的药物浓度是分析方法的首要因素,B:样品中的药物浓度10,-6,-10,-9,g/ml,C:HPLC法检测限：,紫外（UV）1ng；荧光0.1ng；电化学（EDD）0.01ng,二.分析方法的建立,1.检测条件的筛选,A:取标准物质,待测物质；内标物质,B:根据已知的分析方法进行测定,C:根据测定结果确定最佳条件：,溶液pH值；温度及时间；试剂用量；色谱条件,2.分析条件的选择,1）空白溶剂试验,A:取待测药物非生物基质溶液，按拟定的方法预处理，分析方,法的特异性,B:空白响应值应尽可能小或可忽略,2）空白生物基质试验,A:取空白生物基质（血、组织匀浆），,照空白溶剂试验下操作,B:考察杂质对测定的影响,C:杂质不干扰测定,3）模拟生物样品试验,A:取空白生物基质加入待测物制成模拟生物样品,B:照空白生物基质试验下操作,C:考察方法的专一性；线性范围；最小检测限；精密度；灵敏度；萃取回收率,4）实际生物样品测定,A:预试,确定实际生物样品与模拟生物样品一致性,B:正式试验,按所建立的分析方法分析,C:比较实际生物样品与模拟生物样品相应特点,D:计算体内药物浓度,第三节 分析方法的验证内容和要求,一.分析方法的选择,A:用于实际样品分析之前，对所建立的方法的可靠性、可行,性，应使用若干技术指标验证,B:验证步骤,分析方法验证；实际生物样品中药物测定,一）特异性：,又称专属性、专一性，与选择性互用,A:是指当有杂质存在时，方法准确测定待测物的能力。通常表,示所检测的信号应属于待测物所特有,B:用来验证该方法所测定的物质是目标物质，且不受非目标物,质的干扰,1.内源性物质的干扰,A:比较待测物的对照品、空白生物基质、模拟生物样品的检测,信号，确证内源性物质对分析物有无干扰,B:比较的内容,T,r,；n；T；R,2.代谢产物干扰,比较模拟生物样品和实际生物样品的检测信号（T,r,；n；T；,R），确证代谢产物对分析物有无干扰,3.配伍用药的干扰,A:比较待测药物、同时服用的药物、空白生物样本、待测药物模拟生物样品、待测药物+同时服用的药物模拟生物样品的检测信号,B:比较的内容,T,r,；n；T；R,4.与参比方法的相关性,A:参比方法选择（HPLC、GC）,B:同时用两种方法测定不同浓度的系列含药生物样品,C:参比方法测得值为横坐标（x），拟定的方法测得值为纵座,标（y），求回归方程y=a+bx，r为一致成度；a为拟定方法,受恒定干扰程度；b为拟定方法受比例干扰程度。,D:r=1 a=0 b=1 两种方法一致,二）标准曲线与线性范围,A:又称校正曲线、工作曲线。是指生物样品中药物浓度与所测,定的该药物的检测信号的相关性，通常用回归方程评价。,B:大多数方法的标准曲线为线性模式。回归方法为最小二乘法,和加权最小二乘法,C:生物样品中药物浓度为自变量（x），检测信号为因变量（y），回归方程为y=a+bx，r为相关系数,D:线性范围，,浓度不能外推,E:标准曲线模拟生物样品的,生物基质,应使用与待测的实际生物,样品的,生物基质,相同,1.,标准曲线系列溶液的配制,1）精称标准药物适量，,配贮备液,2）精量,配贮备液适量,，,配制系列标准溶液,3）系列标准溶液浓度为模拟生物样品浓度的50倍,4）加量为生物样本体积的2%,5）难溶药物，适当降低系列标准溶液浓度，蒸干,6）线性模拟的标准曲线5-8点；线性模拟的标准曲线增加,7）标准曲线系列浓度为等梯度，公比为2,2.内标物溶液的配制,1）精称内标物适量，,配内标物贮备液,2）精量,配贮备液适量,，,配制内标物标准溶液,3）内标物标准溶液浓度为“标准曲线系列浓度”的中间浓度,3.标准系列模拟生物样品的配制,1）取空白血数份，加入“标准曲线系列浓度”适量,（在加入内标液适量）,，混匀,2）标准系列模拟生物样品高低浓度比,1/10-1/20,3）同时配制空白样C=0,4）防止生物基质中加入过多溶剂，干扰测定，可将标准液和,内标液先加到试管中，,蒸干后加生物基质,4.标准曲线的绘制,1）以待测物的响应值（A；h）或与内标物的响应值的比（A,1,/A,2,；h,1,/h,2,）为（y）对浓度（x），回归得y=a+bx及r。绘,制标准曲线。,2）回归分析时在至少7个浓度构成的标准曲线中，至多2个浓度点数据因确切原因,“离群”，,可剔出，余至少5点数据线性良好。,5.限度要求,1）标准曲线5-8浓度，最高和最低浓度比1/10-1/20,2）回归方程a应近于零，斜率b接近1或大于1，系数R接近1，,HPLC R0.99；生物学法R0.98。,3）需分区制备标准曲线（最高和最低浓度比100）,三）准确度,指用该法测得的生物样；样品中待测药物的浓度与其真实浓,度的接近程度。,1.测定法,取空白生物基质数份，照“标准曲线下”配制，至少选标准,曲线的高、中、低3个浓度样品。每个浓度5个平行样，每个,样测定一次。与随行的标准曲线同测定,2.结果计算与限度分析,1）用随行的标准曲线计算测得浓度（内、外标），测得值M的平均值M,平,与配制理论值（A）比，计算回收率（RR）或相对误差（RE）,2）RR=M,平,/A100；RE=（M,平,-A）/A100,3）RR在85-115%内，低浓度80-120%；RE15%，低浓度20%,四）精密度,指用1次测定结果与多次测定结果的平均值的偏离程度。表示分析方法的可重复性。,1.表示方法,方法精密度用SD或RSD表示,，RSD=SD/X,平均,100,1）批内RSD,又称日内RSD,2）批内RSD,又称日间RSD,2.测定方法,1）批内RSD,A:同一分析批（日内）,B:随行标准曲线,C:高、中、低3种浓度，每种浓度5个平行样，每样测定一次。,D:计算日内,RSD,2）批间RSD,A:5个工作日，每个工作日完成一个分析批测定,B:每一个分析批随行1条标准曲线,C:每一个分析批测高、中、低3种浓度样品，每种浓度1个样，,每样测定1次。,D:用随行的标准曲线计算日间RSD,3.限度要求,药代动力学、生物利用度：g/ml水平RSD10%；ng/ml水平,RSD15%，在最低检测浓度附近RSD20%,五）定量限,A:方法定量限(LOQ)与检测限(LOD)均表示分析方法检测低浓度,样的能力，通常称为方法灵敏度,B:LOD指在噪音水平下识别生物样本中药物的最低浓度,C:当信噪比（S/N）3时，该信号有效。将S/N=3时样品的浓,度作为LOD,D:LOQ,指保证具有一定可靠性的前提下，该方法能准确测定生物样品中药物的最低浓度,E:LOQ的检测响应值为,LOD的两倍以上，为S/N=10时的样品浓度,作为LOQ的估计值。,F:体内分析中标准曲线的LOQ估计LOQ,1.测定方法,取同一生物基质，制备至少5个独立的生物样本，其浓度应使,S/N10，依法进行准确度、精密度验证,2.限度要求,A:生物样本测得的LOQ平均浓度在其表示浓度的20%,B:生物样本测得的LOQ其RSD20%,C:LOQ小于测定3-5半衰期后生物样品中的药物浓度或小于,Cmax的1/10,六）稳定性,1.方法稳定性,A:考察待测物的标准物、其分析溶液在室温、光照等稳定性,B:方法建