第04章中药制剂的含量测定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Pharmaceutial analysis of TCM,Page,*,KHANS TRAINING MANUAL,Copyright belongs to hanbo 2006,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,ANALYTICAL,CHEMISTRY,Page,*,KHANS ANALYTICAL CHEMISTRY TRAINING MANUAL,Copyright belongs to hanbo 2006,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,ANALYTICAL,CHEMISTRY,Page,*,KHANS ANALYTICAL CHEMISTRY TRAINING MANUAL,Copyright belongs to hanbo 2006,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Page,*,Copyright Presentation Solutions Ltd 2006,KHANS ANALYTICAL CHEMISTRY TRAINING MANUAL,ANALYTICAL,CHEMISTRY,Pharmaceutial analysis of TCM,掌握中药制剂含量测定中样品处理的方法,掌握可见,-,紫外光谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法及荧光分析法的基本原理，了解其操作。,教学基本要求,Pharmaceutial analysis of TCM,含义,是利用各种化学和仪器分析的方法对中药制剂中有代表性的成分、有效成分或毒性成分进行含量测定的技术。,内容,包括,化学分析法,和,仪器分析法,两大类。由于中药制剂组成复杂，,仪器分析法更为常用,。,目的,以达到临床安全有效的目的。,意义,控制药品质量，,1 含量测定的目的和意义,Pharmaceutial analysis of TCM,2.2 样品的提取,方法,1.冷浸法,2.回流提取法,3.连续回流提取法,4.超声提取法,5.超临界流体提取法,Pharmaceutial analysis of TCM,2.2 样品的提取,Pharmaceutial analysis of TCM,超声提取技术,超声提取是利用超声波(频率20KHz)具有的机械效应、空化效应及热效应，通过增大介质分子的运动速度，增大介质的穿透力以提取中药有效成分的技术。,Pharmaceutial analysis of TCM,超声提取的原理,原理,热效应,机械效应,空化效应,Pharmaceutial analysis of TCM,组织细胞变形,强化溶质扩散,超声提取的原理机械效应,超声波在介质中的传播可以使介质质点在其传播空间内产生振动，从而强化介质的扩散、传递，即超声波的机械效应。,超声波,传播,振动,振动,Pharmaceutial analysis of TCM,植物细胞,介质内部溶解的微气泡在超声波的作用下增大，形成共振腔，然后瞬间闭合，即超声波的空化效应。,微气泡,超声波,增大,共振腔,形成,破裂,瞬间闭合,超声提取的原理空化效应,Pharmaceutial analysis of TCM,成,分溶,出,介质及,药材组织,导致,超声波的声能被介质所吸收，部分转化成热能，使介质和药材组织温度升高，促使有效成分溶解，这就是超声波的热效应。,超声波,传播,声能,热能,介质吸收,促使,温度升高,超声提取的原理热效应,Pharmaceutial analysis of TCM,人参总皂苷的提取方法比较,时间和效果,提取时间：,5h,浸膏含量：,50,总皂苷含量：,4.2,时间和效果,提取时间：,6h,浸膏含量：,53,总皂苷含量：,8.3,水煎法,温浸法,时间和效果,提取时间：,24h,浸膏含量：,46,总皂苷含量：,8.4,时间和效果,提取时间：,0.5h,浸膏含量：,25,总皂苷含量：,7.3,乙醇回流,微波提取,时间和效果,提取时间：,1h,浸膏含量：,37,总皂苷含量：,8.3,超声提取,Pharmaceutial analysis of TCM,超临界流体,Pressure/(P),Temperature/(T),Pc,Solid,Liquid,Gas,Triple Point,Tc,Critical Point,Supercritical Region,Pressure-Temperature diagram of a pure component,Pharmaceutial analysis of TCM,超临界流体,物质处于其临界温度（Tc）和临界压力（Pc）以上状态时，向该状气体加压，气体不会液化，只是密度增大，具有类似液态性质，同时还保留气体性能，该种流体即为超临界流体。,性质,气体,超临界流体,液体,101.325KPa,1530,T,c,P,c,T,c,4,P,c,1530,密度/（g/mL）,粘度/g/(cm.s),扩散系数/（cm,2,/s）,（0.62）10,-3,（13）10,-4,0.10.4,0.20.5,（13）10,-4,0.7 10,-3,0.40.9,（39）10,-4,0.2 10,-3,0.61.6,（0.23）10,-2,（0.23）10,-5,Pharmaceutial analysis of TCM,超临界流体,超临界流体具有液体对溶质有比较大的溶解度的特点，又具有气体易于扩散和运动的特性。,在临界点附近，压力和温度微小的变化都可以引起流体密度很大的变化，并相应的表现为,溶解度,的变化。,Pharmaceutial analysis of TCM,2.3 样品的分离净化,方法,1.沉淀法,2.蒸馏法,3.液-液萃取法法,4.色谱法,5.固相微萃取技术,6.消化法,Pharmaceutial analysis of TCM,2.3,样品的分离净化,Pharmaceutial analysis of TCM,离子交换色谱,Pharmaceutial analysis of TCM,离子交换色谱,Pharmaceutial analysis of TCM,(五)固相微萃取技术,固相微萃取技术（SPME）是近年来兴起的试样分离前处理技术，1993年推出商品化的SPME装置。是在LSE基础上发展起来的，能直接采集挥发和非挥发性的化合物,。,Pharmaceutial analysis of TCM,(六)消化法,当测定中药制剂中无机元素时，由于大量有机物的存在严重干扰测定。因此必须采用合适的方法破坏这些有机物质。,1.湿法消化,硝酸-高氯酸法,硝酸-硫酸法,硫酸-硫酸盐法,2.干法消化,Pharmaceutial analysis of TCM,第二节 含量测定方法的验证,含量测定方法验证的目的是证明采用的分析方法是否适合于相应的检测要求，对分析方法的验证可以作为对分析方法评估的尺度，也可为建立新分析方法提供实验研究依据。,验证的主要内容有：,准确度、精密度、专属性、线性、范围和耐用性,。,Pharmaceutial analysis of TCM,第二节 含量测定方法的验证,一、准确度,用已知浓度的对照品做加样回收测定，即于已知被测组分含量的供试品中再加入一定量的已知纯度的被测成分对照品、依法测定。,要求：,取同,一,浓度的对照品用,6,个测定结果进行评价,取同,三,个不同浓度的对照品用,9,个测定结果进行评价,Pharmaceutial analysis of TCM,第二节 含量测定方法的验证,二、精密度,经多次测量所得到的结果之间接近程度。,1 重复性：,同一分析人员较短时间内测定的结果,2 中间精密度：,同一实验室不同时间、不同分析人员测定的结果,3 重现性：,被定为法定标准后，不同实验室测定的结果。,Pharmaceutial analysis of TCM,第二节 含量测定方法的验证,三、专属性,专属性系指在其他组分存在下，采用的方法能正确测定出被测组分的特性。,图2甘草酸二铵在兔血浆中的色谱图,(A)空白血浆；(B)甘草酸二铵对照品；(C)灌胃1 h 后血浆样品,Pharmaceutial analysis of TCM,第二节 含量测定方法的验证,四、线性,制备一系列供试品的方法进行测定，至少制备6个浓度的供试品。,Pharmaceutial analysis of TCM,第二节 含量测定方法的验证,五、范围,范围系指能达到一定精密度、准确度和线性测试方法适用的高低浓度和量的区间。,六、耐用性,当实验条件有小变动时测定结果不受影响的承受程度。,Pharmaceutial analysis of TCM,一 化学分析法,包括重量分析和滴定分析,所用仪器简单，结果准确，主要用于制剂中含量较高的一些成分或矿物药 制剂中的无机分析,灵敏度低，操作繁琐，耗时长，专属性不高，对微量成分测定的准确性不理想,第三节 常用定量分析方法,Pharmaceutial analysis of TCM,分为,挥发法,，,萃取法,和,沉淀法,挥发法：测定具有挥发性或定量转化为挥发性物质的组分含量,萃取法：根据被测组份在互不相溶的两相中溶解度不同，达到分离的目的,沉淀法：将被测组份定量专为难溶性化合物，测定其含量的方法，适用于制剂中纯度较高的成分。,（一）重量分析法,第三节 常用定量分析方法,Pharmaceutial analysis of TCM,分为酸碱滴定，沉淀滴定，配位滴定，氧化还原滴定等,酸碱滴定法适用于中药制剂中所含的生物碱，有机酸组分的含量,沉淀滴定法分为银量法，四苯硼钠法和亚铁氰化钾法等，中药用于测定生物碱，生物碱的氢卤酸盐以及含卤素的其他有机成分的含量。,（二）滴定分析法,第三节 常用定量分析方法,Pharmaceutial analysis of TCM,常用的配位滴定法包括,EDTA,法和硫氢酸铵法，用于测定鞣质、生物碱及含有,Ca,2+,、,Mg,2+,、,Fe,3+,，,Hg,2+,等矿物类制剂的含量,氧化还原滴定法适用于测定具有氧化还原性的物质。,滴定分析法,第三节 常用定量分析方法,Pharmaceutial analysis of TCM,是中药及其制剂含量测定的常用方法，具有灵敏度高，精度好，造作简单等优点。,要求被测组分本身或其显色产物对可见-紫外光具有选择性吸收。,按测定波长不同可分为单波长光度法和计算分光光度法。,可见-紫外分光光度法,Pharmaceutial analysis of TCM,（一）单波长光度法,测定前，必须经过适当的提取，净化，或采用专属的显色反应等步骤来排除干扰。,选择,max进行定量分析，而共存组分在此波长处基本无吸收。,吸收度读数控制在0.3-0.7之间,可见-紫外分光光度法,Pharmaceutial analysis of TCM,1 吸收系数法,按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时，吸收系数通常应大于100，并注意仪器的校正和检定。,可见-紫外分光光度法,Pharmaceutial analysis of TCM,2 对照品比较法,按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分规定量的100,10,所用溶剂也应完全一致。,3.2 可见-紫外分光光度法,Pharmaceutial analysis of TCM,3 标准曲线法,先配制一系列浓度不同浓度的对照品溶液,在相同条件下测定吸收度,绘制A/C曲线或求出其回归直线方程（r0.999）,即得标准曲线。在相同条件下测定供试品的吸光度,求得供试品中被测组分的浓度或含量.,在比色法中最常用,可见-紫外分光光度法,Pharmaceutial analysis of TCM,计算分光光度法,供试液中若有两种（两种或两种以上）组分共存，其紫外光谱彼此发生不同程度的重叠时，则可通过测定多个波长处的吸收度，根据吸收度的加和性，采用适当的数学处理方式进行多组分的同时测定，或者用其排除共存组分的干扰，测定其中某个组分。,可见-紫外分光光度法,Pharmaceutial analysis of TCM,系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中可吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、检查或含量测定.,薄层色谱扫描法,Pharmaceutial analysis of TCM,同,HPLC,相比：具有实验成本低，流动相的选择与更换方便等优点,是药物制剂中常用的分析方法之一,2005,版,中国药典,中有,35,中中成药的含量测定才有薄层扫描法,薄层色谱扫描法,Pharmaceutial analysis of TCM,基本原理,一般是指波层色谱斑点的色谱扫描,固定波长，斑点移动，测定A-l或F-l曲线,根据波层扫描的测定方式可分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法,3.3 薄层色谱扫描法,Pharmaceutial analysis of TCM,薄层吸收扫描法,适用于在可见、紫外区有吸收的物质，及通过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分，可分别以氘灯和钨灯为光源，在200-800nm波长范围内选择合适波长进行测定。,斑点中物质的浓度与吸光度的关系需要用Kubelka-Munk理论及曲线来描述,3.3 薄层色谱扫描法,Pharmaceutial analysis of TCM,Kubelka-Munk理论以斑点的相对反射率和相对透光率表示薄层色谱斑点的吸光度，说明了固定相的散射参数SX对斑点中物质的浓度与吸收度间关系的影响，从而获得不同散射参数SX时斑点的A-KX理论曲线，即Kubelka-Munk曲线。,Kubelka-Munk曲线时薄层扫描法进行定量分析的理论依据,薄层吸收扫描法,3.3 薄层色谱扫描法,Pharmaceutial analysis of TCM,薄层荧光扫描法,适用于本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定，光源用氙灯或汞灯，采用直线式扫描。,专属性强，灵敏度比吸收法高1-3个数量级,，最低可测到,10-50pg,样品，但使用范围窄,3.3 薄层色谱扫描法,Pharmaceutial analysis of TCM,当溶液浓度很稀时(ECl,0.05)，荧光强度与激发光强I,0,及物质的浓度C的关系为,F=2.3KI,0,ECl,或F=KC,K为常数（与荧光效率有关），L为薄层板厚度，E为吸光系数,3.3 薄层色谱扫描法,薄层荧光扫描法,Pharmaceutial analysis of TCM,Kubelka-Munk理论不适用于薄层荧光扫描，无需进行曲线校直,用薄层荧光扫描进行定量分析时，用斑点荧光强的的积分值与斑点中组分的含量代替上式中的F与C进行运算。,薄层荧光扫描法,3.3 薄层色谱扫描法,Pharmaceutial analysis of TCM,（二）定量分析方法,1.,方法学考察,（,1,）工作曲线,目的：,检验所选择的散射参数,SX,是否合适,考察工作曲线是否通过原点，以便确定采用一点法或两点法定量,确定点样量的线性范围,3.3 薄层色谱扫描法,Pharmaceutial analysis of TCM,（2）分离度：,用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离（R）的计算公式为：,R=2（d,2,-d,1,）/(W,1,+W,2,),式中：d,2,为相邻两峰中后一峰与原点的距离；d,1,为相邻两峰中前一峰与原点的距离；W1及W2为相邻两峰各自的峰宽。,除另有规定外，分离度应大于1.0。,3.3 薄层色谱扫描法,Pharmaceutial analysis of TCM,（3）重复性,同一供试品溶液在同一薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差应不大于3.0%；需显色后测定的相对标准偏差应不大于5.0%。,3.3 薄层色谱扫描法,Pharmaceutial analysis of TCM,（4）准确度考察,常用加样回收率来衡量，其值应在95%-105%之间，测定数据一般为5-6个,（5）统计检验,包括F检验和t检验,3.3 薄层色谱扫描法,Pharmaceutial analysis of TCM,（一）基本原理,气化后的试样被载气带入色谱柱，由于各组分在两相间的作用不同，在色谱柱中移动有快有慢，经一定柱长后得到分离，以此被载气带入检测器，将各组分浓度或质量变化转化为电信号变化记录为色谱图，利用色谱峰保留值进行定性分析，利用峰面积或峰高进行定量分析。,3.4 气相色谱法,Pharmaceutial analysis of TCM,3.4 气相色谱法,1、高压钢瓶,2、减压阀,3、载气净化干燥管,4、针形阀,5、流量剂,6、压力表,7、进样器,8、色谱柱,9、检测器,10、记录仪,气相色谱流程图,Pharmaceutial analysis of TCM,(1)色谱柱的理论板数(n),n,（）,t,R,=5.54,t,R,W,1/2,=16,（）,t,R,W,（）,3.4 气相色谱法,Pharmaceutial analysis of TCM,2.速率理论,H=A+B/u+Cu,3.4 气相色谱法,Pharmaceutial analysis of TCM,3.分离度,2(t,R2,t,R1,),R,W,1,W,2,3.4 气相色谱法,Pharmaceutial analysis of TCM,4.系统适应性,（1）色谱柱的理论塔板数,（2）分离度 R1.5,（3）重复性 2.0%,（4）拖尾因子 0.95-1.05,3.4 气相色谱法,Pharmaceutial analysis of TCM,（二）实验条件的选择,1.,固定相的选择,2.,柱温的选择,3.,载气的选择,4.,其他条件的选择,5.,检测器,3.4 气相色谱法,Pharmaceutial analysis of TCM,定量分析方法,（1）内标法加校正因子,（2）外标法,（3）归一法,（4）标准溶液加入法,3.4 气相色谱法,Pharmaceutial analysis of TCM,（一）基本原理,(1)色谱柱的理论板数(n),n,（）,t,R,=5.54,t,R,W,1/2,=16,（）,t,R,W,（）,3.5 高效液相色谱法,Pharmaceutial analysis of TCM,速率理论,H=A+Cu,3.5 高效液相色谱法,Pharmaceutial analysis of TCM,（二）实验条件的选择,.色谱柱选择,.流动相选择,.洗脱方式,.检测器,.前处理,3.5 高效液相色谱法,Pharmaceutial analysis of TCM,法分类及方法,.键合相色谱法,.胶束色谱法,.反相键合相色谱,.正相键合相色谱,.离子对色谱法,.离子抑制色谱法,3.5 高效液相色谱法,Pharmaceutial analysis of TCM,3.6 荧光分析法,Pharmaceutial analysis of TCM,3.7,原子吸收分光光度法,Pharmaceutial analysis of TCM,