葡聚糖凝胶柱层析专业知识讲座.ppt

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mol/L,柠檬酸缓冲液,(pH3.5),：取柠檬酸,(C,6,H,8,0,7,.H20)16.2g,，柠檬酸三钠,(Na,3,C,6,H,5,0,7,.2H,2,0)6.7g,。用蒸溜水溶解，定容到,2000ml,。,3,、,腺苷酸溶液,：,AMP,、,ADP,、,ATP,，用水配成,50mg/ml,。,二、仪器与试剂：,三、实验步骤：,1,、准备好电泳槽，向二边槽内加入柠檬酸缓冲液,(pH3.5),，使两边等高。,2,、醋酸纤维素薄膜裁成,28cm,，先在蒸馏水润湿，然后凉干。在粗糙面距一端,1.5cm,画一条线，标出点样点。,3,、点样：用毛细管在点样点处点样,2-3,次，,注意斑点直径,2,3mm,。,4,、在电泳槽的阳极和阴极放入滤纸，使其下端浸入电泳缓冲液中。,5,、粗糙面朝上，将醋酸纤维膜平稳地放在电泳槽的滤纸架上，注意二点：点样点在负极。滤纸桥与醋酸纤维膜贴紧。,6,、盖上电泳槽的盖子，平衡,10,分钟,.,7,、接上电极，点样端在负极，接通电源，调整电压在,100V,，室温通电,40,分钟。,8,、电泳完毕后，关闭电源，取出滤纸，电吹风吹干。,9,、在紫外灯下观察，可见核苷酸的深蓝色斑点。,画出核苷酸在醋酸纤维膜上的位置，并分析其分离依据。,四、结果与讨论,：,实验,1-2,Sephadex G-50,分离生物大分子,1,、凝胶层析法的原理：,凝胶层析,是一种液相层析，其原理是,分子筛效应,。,根据不同分子的,分配系数,不同而分离。,当洗脱开始以后，小分子可进入凝胶颗粒内部，流程长，流动慢；大分子不能进入凝胶颗粒内部，流程短，流动快。这样，就可使大小不同的分子分开。,总体积：,Vt,(total volume),，,外水体积：,Vo,(outer volume),内水体积：,Vi,(inner volume),洗脱体积：,Ve,(elution volume),干胶体积：,Vg,(gel volume),Vt,（床体积）,=Vo+Vi+Vg,Ve,（洗脱体积,=Vo+,Kd,Vi,。,层析的几个主要参数：,Kd,值的计算与意义：,Kd=(Ve-Vo)/Vi,Kd=0,则,Ve=Vo,，,全排阻,；,Kd=1,则,Ve=Vo+Vi,，,全掺入,；,0,Kd1,，则,VeVo+Vi,，,Sephadex,对它们,有吸附作用，,如芳香族,AA,。,2,、影响凝胶层析分离的因素：,2.1,、,样品,的体积、粘度。,2.2,、,层析柱,：（高度，内径，材质）。,2.3,、,洗脱液,的流速：,过慢：扩散；过快：拖尾。,2.4,、,洗脱液,的离子强度、,pH,。,2.1,、样品的体积、粘度：,分析分离时：,V,sample,=1-4%V,bed,；,制备分离时：,V,sample,=25-30%V,bed,.,分离体积,(V,sep,):,相邻两组分,V,e,之差，用于衡量相邻两组分的分离效果。,V,sep,=V,e1,-V,e2,，,当,V,sample,V,sep,时，则相邻两组分可完全分离。,相对粘度：,样品液粘度与洗脱液粘度的比值。分离效果只与相对粘度有关，一般来说，相对粘度不得超过,1.52,。,今天的上样量（,0.5ml,）约为,1%,柱床体积。,2.2,、层析柱：,柱长：,组别分离,时，,5,30,厘米；,分级分离,时，可长至,100,厘米；,柱径：,分析分离,时，由于样品量少，常使用,1,厘米直径的层析柱，若制备分离时样品量大，最好使用直径,2,3,厘米的层析柱。,今天选用的是,2cm 50cm,的层析柱。,2.3,、洗脱液的离子强度和,pH,值：,多糖类：水是最佳洗脱剂。,蛋白类：离子强度,0.02M,的盐溶液作洗脱剂，以消除凝胶的吸附作用。,pH,7,时，酸性物质易被洗脱。,pH,7,时，碱性物质易被洗脱。,3,、凝胶层析法的应用：,1,、,分子量的测定,:,利用已知分子量的标准蛋白洗脱，制备洗脱标准曲线。,2,、,多组分混合物的分离,:,利用,Kd,的差异分离。,3,、,脱盐与分离纯化,:,用于脱盐的凝胶多为颗粒大、交联度高的凝胶。,此时，溶液中大分子（如蛋白质）的,kd=0,，盐类的,kd=1,，易于分离脱盐。,4,、凝胶的特性、种类、使用与保存：,凝胶,是一种具有立体网状结构的物质（如葡聚糖、,琼脂糖、聚丙烯酰胺等,),吸收大量液体（水或洗脱,液）溶胀而成。,4.1,、凝胶的特性：,1,、惰性：保证其不与待分离物质发生化学反应。,2,、稳定。,3,、低电荷：避免离子交换效应的发生。,4,、足够的机械强度：在一定的操作压下不形变。,4.2,、凝胶的几种主要类型：,1,、天然凝胶：,马铃薯淀粉凝胶、琼脂及,琼脂糖凝胶,。,2,、人工合成凝胶：,聚丙烯酰胺凝胶、,交联葡聚糖凝胶,。,葡聚糖凝胶 的型号：,目前，,凝胶层析法中使用最广泛的一类层析凝胶，商品名称：,Sephadex,。其基本骨架是,葡聚糖,，它是由,右旋葡萄糖残基,通过,1,，,6,糖苷键,连接而成，葡聚糖分子之间通过,醚桥,（甘油基）交联形成三维空间网状结构。,凝胶过滤介质名称,分离,范围,颗粒,大小,（,m,）,特性,/,应用,pH,稳定性,工作,干凝胶,溶胀体,积,mL/g,溶胀最少,平衡时间,h,最快,流速,(cm/h),室温,沸水,SephadexG-10,SephadexG-15,SephadexG-25,Coarse,SephadexG-25 Medium,SephadexG-25 Fine,SephadexG-25 Superfine,SephadexG-50,Coarse,SephadexG-50 Medium,SephadexG-50 Fine,SephadexG-50,Superfine,SephadexG-75,SephadexG-75 Superfine,SephadexG-100,SephadexG-100,Superfine,SephadexG-150,SephadexG-150,Superfine,SephadexG-200,SephadexG-200,Superfine,700,1500,10005000,10005 000,10005000,10005000,150030000,150030000,150030000,150030000,300080000,300070000,40001.510,5,4000110,5,5000310,5,50001.510,5,5000610,5,50002.510,5,干粉,40120,干粉,40120,干粉,100300,干粉,50150,干粉,2080,干粉,1040,干粉,100300,干粉,50150,干粉,2080,干粉,1040,干粉,40120,干粉,1040,干粉,40120,干粉,1040,干粉,40120,干粉,1040,干粉,40120,干粉,1040,脱盐及交换缓冲液用,脱盐及交换缓冲液用,脱盐及交换缓冲液用,脱盐及交换缓冲液用,小分子蛋白质分离,小分子蛋白质分离,小分子蛋白质分离,小分子蛋白质分离,中等蛋白质分离,中等蛋白质分离,中等蛋白质分离,中等蛋白质分离,稍大蛋白质分离,稍大蛋白质分离,较大蛋白质分离,较大蛋白质分离,213,213,213,213,213,213,210,210,210,210,210,210,210,210,210,210,210,210,23,2.53.5,46,46,46,46,911,911,911,911,1215,1215,1520,1520,2030,1822,3040,2025,3,3,6,6,6,6,6,6,6,6,24,24,48,48,72,72,72,72,1,1,2,2,2,2,2,2,2,2,3,3,5,5,5,5,25,25,25,25,25,25,25,25,25,25,72,16,47,11,21,5.6,11,2.8,4.3,、,Sephadex,的使用原则：,1,、型号选择：,组别分离：,Sephadex G,25,最为常用。例如 样品中缓冲液的更换，蛋白质的脱盐；,分级分离：,多种蛋白质分离时，根据待分离物中各组分的分子量大小和分布范围来确定型号。同时，参考商家产品信息。,2,、粒度的选择：,组别分离时,，选用较粗的颗粒。,分级分离时,，以细颗粒凝胶为主，而且要求颗粒大小均匀。,同型号的胶，同样的床体积，粒度小的胶对样品的分离度要优,于粒度大的胶，即有较高的分辨率。,4.4,、凝胶的防腐、保存：,Sephadex,、,Sepharose,是多糖类物质，易于长菌。因,此，常在凝胶不用时，加入抑菌剂，使用时再除去。,1.,常用,0.02,叠氮钠,作防腐剂。,2.,常用,20,乙醇,溶液保存各类凝胶。,5,仪器、材料：,1,、,仪器与材料：,柱层析装置、,Sephadex G-50,。,2,、,样品混合物：,蓝色葡聚糖,-200(MW=2000kDa,蓝色,),、细胞色素,C(MW=12.4kDa,，红色,),和重铬酸钾,(K,2,Cr,2,O,7,MW=294.18,，黄色,),的混合物。,3,、,洗脱液,：蒸馏水。,6,、实验步骤：,6.1,、凝胶用量的计算。,6.2,、凝胶的溶胀。,6.3,、装柱与平衡。,6.4,、上样。,6.5,、洗脱和收集。,6.6,、绘制洗脱曲线。,6.7,、凝胶的回收与保存。,6.1,、凝胶用量的计算：,根据层析柱的容积和所选凝胶溶胀后的柱床体,积计算出所需凝胶干粉的重量。,凝胶的克数,V,bed,V,c,。,凝胶过滤介质名称,分离,范围,颗粒,大小,（,m,）,特性,/,应用,pH,稳定性,工作,干凝胶,溶胀体,积,mL/g,溶胀最少,平衡时间,h,最快,流速,(cm/h),室温,沸水,SephadexG-10,SephadexG-15,SephadexG-25,Coarse,SephadexG-25 Medium,SephadexG-25 Fine,SephadexG-25 Superfine,SephadexG-50,Coarse,SephadexG-50 Medium,SephadexG-50 Fine,SephadexG-50,Superfine,SephadexG-75,SephadexG-75 Superfine,SephadexG-100,SephadexG-100,Superfine,SephadexG-150,SephadexG-150,Superfine,SephadexG-200,SephadexG-200,Superfine,700,1500,10005000,10005 000,10005000,10005000,150030000,150030000,150030000,150030000,300080000,300070000,40001.510,5,4000110,5,5000310,5,50001.510,5,5000610,5,50002.510,5,干粉,40120,干粉,40120,干粉,100300,干粉,50150,干粉,2080,干粉,1040,干粉,100300,干粉,50150,干粉,2080,干粉,1040,干粉,40120,干粉,1040,干粉,40120,干粉,1040,干粉,40120,干粉,1040,干粉,40120,干粉,1040,脱盐及交换缓冲液用,脱盐及交换缓冲液用,脱盐及交换缓冲液用,脱盐及交换缓冲液用,小分子蛋白质分离,小分子蛋白质分离,小分子蛋白质分离,小分子蛋白质分离,中等蛋白质分离,中等蛋白质分离,中等蛋白质分离,中等蛋白质分离,稍大蛋白质分离,稍大蛋白质分离,较大蛋白质分离,较大蛋白质分离,213,213,213,213,213,213,210,210,210,210,210,210,210,210,210,210,210,210,23,2.53.5,46,46,46,46,911,911,911,911,1215,1215,1520,1520,2030,1822,3040,2025,3,3,6,6,6,6,6,6,6,6,24,24,48,48,72,72,72,72,1,1,2,2,2,2,2,2,2,2,3,3,5,5,5,5,25,25,25,25,25,25,25,25,25,25,72,16,47,11,21,5.6,11,2.8,6.2,、凝胶的溶胀：,称取,3克Sephadex G-50,凝胶干粉投入烧杯中，加,60mL蒸馏水，在沸水中溶胀2小时。,沸水浴溶胀的好处：,省时,，还可,消毒,，,驱除,凝胶颗粒内部的,气泡,。,6.3,、装柱与平衡：,将洗净的层析柱,垂直,固定在支架上。柱内装满蒸馏水，排除层析柱连接系统内的空气，关闭出口。打开柱底部的夹子，调节流速，以,0.5mL/min,流速慢慢流下，柱内留下约,2/3,柱体积的蒸馏水。然后，一边用玻棒搅拌，一边用滴管缓慢地加入,Sephadex G-50,浆液，使凝胶均匀沉降。连续地灌注凝胶浆液，直到凝胶沉降到距上端,5 cm,为止。胶床上部保持,2-3 cm,水层，关闭下部出口。室温静置,2 h,，以平衡凝胶。,注意点：防止胶床出现气泡、断层。,6.4,、上样：,上样前：,1.,柱子要用洗脱液洗脱平衡。,2.,除去胶面之上的液体：用吸管吸，或打开层析柱下的止水夹，使凝胶表面上的蒸馏水刚好流入胶面，迅速关闭止水夹，以防空气进入凝胶。,上样：,用自动进样器吸取,0.5 ml,混合样品，小心地加到,柱床表面,（切勿冲动胶面），,保持胶面平整,.,使样品液成一薄层,。,2.,随即打开层析柱下面的出口，使样品,完全,进入胶柱内。,3.,用滴管小心地加少许蒸馏水到凝胶的上表面。使胶面上保持,2-3cm,厚的水层。,4.,同时，接通洗脱液，用刻度试管，分别收集洗脱液,。,6.5,、洗脱和收集：,调节洗脱液流速为,0.5 ml/min,仔细观察柱内样品分离现蒙，用刻度试管收集并置取洗脱液的体积。等兰色到柱的烧结板时再另换一个刻度试管收集，用刻度试管收集并量取洗脱液的体积。,注意观察样品的分离现象。最后，根据记录的实验结果，计算层析柱的,Vo,、,Vi,以及样品的,Ve,、,Kd,。,6.6,、绘制洗脱曲线：,在座标纸上以洗脱体积为横座标，以洗脱液颜色深度为纵座标，绘制洗脱曲线。,凝胶回收：,先用,2-3,倍凝胶体积的蒸馏水过柱，然后将凝胶倒入烧杯内，用过量的蒸馏水充分漂洗，最后转入布氏漏斗抽洗，除去盐分及其他可溶性杂质。,凝胶的保存：,湿法保存和干法保存。,6.7,、凝胶回收与凝胶保存：,1,、画出,3,种物质洗脱曲线，计算细胞色素,c,分配系数。,2,、,Sephadex G-50,分离生物大分子的技术体系。,7,、结果与讨论：,