发酵工程：3第三章 发酵工业培养基及其设计.ppt

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。,发酵培养基的作用：,满足菌体的生长,促进产物的形成,发酵培养基,发酵培养基的要求,培养基能够满足产物最经济的合成。,发酵后所形成的副产物尽可能的少。,培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源,丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的,供应。,所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响,通气、提取、纯化及废物处理等。,发酵培养基,第一节 培养基的类型及功能,培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型,一、按纯度,合成培养基,:,原料其化学成分明确、稳定,适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律,培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业,生产,天然培养基,:,采用天然原料,原料来源丰富,(,大多为农副产品,),、价格低廉、适于工业,化生产,原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性,发酵培养基,培养基的类型及功能,M,培养基,(1L),：,Na,2,HPO,4,6g,，,KH,2,PO,4,3g,，,NaCl 0.5g,，,NH4Cl 1g,，,MgSO4.7H2O 0.5g,，,CaCl2 0.011g,，葡萄糖,2-10,pH 7.0,YPS,培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）,10g,，酵母提取物（英国,Oxoid,）,5g,NaCl 10g,，,PH 7.2,培养大肠杆菌常用两种培养基,发酵培养基,培养基的类型及功能,二、按状态,固体培养基,:,适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产,半固体培养基,:,即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为,0.5%,0.8%,主要用于微生物的鉴定。,液体培养基,:80%,90%,是水，其中配有可溶性的或不溶性 的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。,三、按用途（从发酵生产应用考虑）,培养基按其用途可分为,孢子（斜面）,培养基、,种子,培养基和,发酵,培养基三种,发酵培养基,培养基的类型及功能,第二节 发酵培养基的成分及来源,一、碳源,1,、作用,提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分,提供合成目的产物所必须的碳成分,2,、来源,糖类、油脂、有机酸、正烷烃,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,3,、工业上常用的糖类,葡萄糖,所有的微生物都能利用葡萄糖,但是会引起葡萄糖效应,工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质,量指标,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,糖蜜,糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物,。,糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达,50%,75%,。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜,。,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,糖蜜使用的注意点：,除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。,例：谷氨酸发酵,有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）,生物素（发酵控制）,预处理：澄清脱钙脱除生物素,例：柠檬酸发酵,有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）,预处理：黄血盐,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,淀粉、糊精,使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类,缺点：难利用、,发酵液比较稠、一般,2.0%,时加入一定的,-,淀粉酶,成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。,优点：来源广泛、价格底,难利用，可以解除葡萄糖效应,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,例：地衣牙孢杆菌生产,-,淀粉酶,碳源对生长和产酶的影响,碳源 细胞量,-,淀粉酶,葡萄糖,4.2 0,蔗糖,4.02 0,糊精,3.06 38.2,淀粉,3.09 40.2,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,李江华，无锡轻工大学学报，,2004,(,半纤维素酶,),(1.5g,麸皮,),发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,嗜碱芽胞杆菌,(AC-2),中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响,结果：各种碳源相差不大,推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型,苏勤，林业化学与工业，,2004,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,二、氮源,氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。,1,、无机氮源,种类：,氨盐、硝酸盐和氨水,特点：,微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起,pH,的变化如：,(NH,4,),2,SO,4,2NH,3,+2H,2,SO,4,NaNO,3,+4H,2,NH,3,+2H,2,O+NaOH,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫,生理酸性物质,，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为,生理碱性物质,，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的,pH,有积极作用。,所以选择合适的无机氮源有两层意义：,满足菌体生长,稳定和调节发酵过程中的,pH,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,毛霉产蛋白酶的研究,陈涛，中国酿造，,2004,初始,pH,的影响,:,pH,偏酸比较好，中性蛋白酶影响大,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,无机氮源的影响：,硫酸铵,硝酸铵,硝酸钠,尿素,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,2,、有机氮源,来源：,工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，,花生饼,粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋,白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒,糟,。,成分复杂,：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机,盐及生长因子。,例 玉米浆：可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸,较多的乳酸,硫、磷、微量元素等,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,氮源使用的一些相关问题：,有机氮源和无机氮源应当混合使用,早期：容易利用易同化的氮源,无机氮源,中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质,有些产物会受氮源的诱导和阻遏,例：,蛋白酶的生产,有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力,开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣,的课题,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,三、无机盐的微量元素,1,、作用：各种不一样,2,、,来源：,C,、,N,源，以盐的形式补充,3,、,用量：根据具体的产品，以实验决定，,P104,4,、,使用注意点,A.,对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和,微量元素在发酵过程中必须加以考虑,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,例：铁离子,青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于,20g/ml,发酵罐必须进行表面处理,B,、使用时注意盐的形式（,pH,的变化）,例,：,黑曲酶,NRRL-330,生产,-,淀粉酶，,P,对酶活的影响,pH,酶活,不加,4.25 120,分钟,加,K,2,HPO,4,5.45 30,分钟,加,KH,2,PO,4,4.62 75,分钟,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,四、生长因子、前体和产物促进剂,从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。,1,、生长因子,如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用,。,有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的,B,簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到,产物,物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。,2,、前体,青霉素：分子量,356,苯乙酸,:,分子量,136,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,作用,：前体有助于提高产量和组份,P107,用量,：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化,率的问题,例：,6000,单位,/ml,的青霉素,G,需要多少苯乙酸,青霉素,6000*0.6,（微克）,36mg/ml,苯乙酸（,36*136,）,/356=13.8mg/ml=1.38%,实际使用时的转化率在,46-90%,之间,例某厂单耗为：,0.337,（,kg/10,亿青霉素）,转化率为：,13.8/,(0.337/0.6)*36,=68%,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,用法,：前体使用时普遍采用流加的方法,前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利,苯乙酸，一般基础料中仅仅添加,0.07%,前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，,流加也有利于提高前提的转化率,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,3,、产物促进剂,所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。,有些促进剂本身是酶的诱导物；,有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善,细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，,也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；,有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,五、水,对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。,水源质量的主要考虑参数包括,pH,值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。,对于酿造行业，水的重要性不言而喻,对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,第三节 发酵培养基的设计和优化,目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,一、培养基成分选择的原则,菌种的同化能力,代谢的阻遏和诱导,合适的,C,、,N,比,1000.2,2.0,pH,的要求,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,（一）、,理论转化率与实际转化率,理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。,实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小,如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个目标,二、成分含量的确定,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,例,:,如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率计算如下,葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为,C,6,H,12,O,6,2C,2,H,5,OH+2CO,2,葡萄糖转化为酒精的理论得率为,2*46,Y,=0.57,162,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,（二）、实验设计,培养基成分的含量最终都是通过实验获得的,合理的实验方法,多因子实验：均匀设计、,正交实验设计、,响应面分析等。,多因子实验,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适,的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采,用一些合理的实验设计方法。,三、培养基设计的步骤,根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑,的问题，初步确定可能的培养基成分；,通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,类胡萝卜素高产菌,Y11,的培养基的优化,郭秒,食品与工业发酵，,2004,类胡萝卜素的作用：色素、营养保健,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,原培养基,:,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,初步确定可能的培养基成分,(,以碳源为例,),发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,通过单因子实验确定适宜的培养基成分,(,以碳源为例,),考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源,进一步：乙酸钠的浓度,2%,比较好,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,结果：,碳源：乙酸钠,0.2%,氮源：氯化铵,0.2%,酵母膏,0.03%,无机盐,:,复合无机盐,0.05%,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,正交设计确定优化的配方,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,改进后培养基,原培养基,改进后培养基的发酵结果,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,四、摇瓶水平到反应器水平的优化配方,摇瓶、反应器培养基研究的两个层次,摇瓶,培养基设计的第一步,反应器,最终的优化的基础配方,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,例：,青霉素发酵,发酵摇瓶：,玉米浆,4%,，乳糖,10%,，,(NH4)SO4 0.8%,轻质碳酸钙,1%,发酵罐,:,葡萄糖流加控制总量,10-15%,，玉米浆总量,4-8%,补加硫酸、前体等,摇瓶发酵培养基和罐的基础培养差别很大,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,摇瓶优化配方：菌种筛选，反应器研究的基础,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,发酵罐：反应器水平,可以得出最,终优化的基,础配方,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,pH,控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,pH,控制摇床在,1,3-,丙二醇,发酵中的应用,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,1,3-,丙二醇的用途：,最重要的用途是作为单体与对苯二甲酸丙二醇聚合生产聚酯聚对苯二甲酸丙二醇酯,(PTT),可作为增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂等用于食品、化妆品和制药等工业,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,PTT,的性能,PTT,PET,涤纶,Nylon,尼龙、锦纶,Acrylic,亚克力,Spandex(Lycra),莱卡、氨纶,柔韧度,+,-,+,+,NA,弹性,+,-,-,-,+,丰满度,+,-,-,+,NA,磨损,+,+,+,-,-,抗污染力,+,+,-,-,-,洗涤牢度,+,+,-,-,-,日晒牢度,+,+,-,+,-,抗静电力,+,+,-,-,NA,色彩密度,-,-,+,+,-,成本,-,+,-,+,-,PTT,最目前性能最好的纤维,被誉为,21,世纪的大型纤维,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,1,3-,丙二醇两步发酵法,糖,甘油,1,3-,丙二醇,酵母,伯氏肺炎杆菌、丁酸梭菌等,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,伯氏肺炎杆菌,1,3-,丙二醇的代谢,甘油,三羟基丙醛,1,3-,丙二醇,二羟丙酮,丙酮酸,乙酸 乙醇,乳酸 丁醇,丁酸 丁二醇,2H,H,2,O,pH,下降,厌氧过程、,pH,下降,2H,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,不同,pH,条件对甘油消耗的影响,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,摇瓶培养基分批培养过程结果,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,补料培养过程,甘油,浓度为,3.43%,，对甘油转化率为,19%,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,1,3-,丙二醇的浓度,5.37%,，,转化率,为,40%,进一步优化培养基后过程,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,1,3-,丙二醇的浓度为,6.72%,，对甘油转化率为,54.7%,，生产强度为,1.9g/L.h,。,进一步优化条件后,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,五、培养基设计时注意的一些相关问题,原料及设备的预处理,原材料的质量,发酵特性的影响,在抗生素发酵生产中往往喜欢所谓的,“,稀配方,”,，因为它既降低成本、灭菌容易、且使氧传递容易而有利于目的产物的生物合成。如果营养成分缺乏，则可通过中间补料方法予以弥补。,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,灭菌,在大规模发酵中应该尽可能的采取连续灭菌的操作，而且保证灭菌条件的稳定是保证发酵稳定的前提,有时避免营养物质在加热的条件下，相互作用，可以将营养物质分开消毒。,有些物质由于挥发和对热非常敏感，就不能采用湿热的灭菌方法,Na,2,HPO,4,+CaCO,3,CaHPO,4,+Na,2,CO,3,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,第四节、重组产品培养基的介绍,大肠杆菌高密度度培养：,碳源：葡萄糖、甘油,氮源：胰蛋白胨、酵母粉,无机盐：磷、镁等,发酵培养基,重组产品培养基的介绍,蛋白胨、酵母粉,(OXOID),章越，生物工程学报，,2004,发酵培养基,重组产品培养基的介绍,动物细胞培养基,基础培养基,:,F12,、,DMEM,等,血清,(5-10%),：胎牛,(FBS),、小牛,(CS),、马,(HS),水：超纯水,其它：,NaHCO,3,（,CO,2,）、抗生素,发酵培养基,重组产品培养基的介绍,本章小节：,培养基,菌体生长所需的营养以及其它必须的条件,了解发酵培养基的组成，发酵培养基常用的原料以,及其中的基本概念,发酵培养基的优化与设计是发酵工程的基本问题，,掌握发酵培养基优化与设计的思路、了解其中的,方法,发酵培养基,小节,发酵培养基,聚类分析在红霉素摇瓶培养基无机盐分析中的应用,发酵培养基,A,：黄豆饼粉,3%,；,B,：棉籽饼粉,2.37%C,：酵母粉,2.74%,；,D,：玉米浆（固体）,2.8%,设计了,A,N,种氮源组合（蛋白质含量相同）：,A,：黄豆饼粉,3%,；,B,：黄豆饼粉,1.5%+,棉籽饼粉,1.18%,；,C,：黄豆饼粉,1.5%+,酵母抽提液,0.96%,；,D,：黄豆饼粉,1.5%+,蛋白胨（进口）,0.78%,；,E,：酵母粉,2.74%,；,F,：棉籽饼粉,2.37%,；,G,：蛋白胨（国产）,1.47%,；,H,：蛋白胨（进口）,1.57%,；,I,：酵母抽提液,1.91%,；,J,：棉籽饼粉,1.18%+,酵母粉,1.37%,；,K,：棉籽饼粉,1.18%+,蛋白胨（国产）,0.74%,；,L,：棉籽饼粉,1.18%+,蛋白胨（进口）,0.78%,；,M,：酵母粉,1.37%+,酵母抽提液,0.96%,；,N,：蛋白胨（国产）,0.74%+,蛋白胨（进口）,0.78%,。,发酵培养基,发酵培养基,钾,(mg/100ml),镁,(mg/100ml,）,锌,(mg/100ml),铁,(mg/100ml),铜,(mg/100ml),磷,(mg/100ml),效价,（,g/ml,）,A,B,C,48.551,41.553,52.206,7.313,0.1319,0.7882,0.0330,18.611,7099,9.944,6.874,0.1553,0.1273,0.5398,0.5649,0.0388,0.0174,22.939,31.952,6355,2883,D,24.411,4.538,0.0896,0.4215,0.0173,15.397,5806,E,F,47.668,5.610,0.1343,0.4609,0.0211,37.924,2136,34.700,12.629,0.1794,0.2927,0.0449,27.382,5323,G,23.753,0.035,0.0095,0.0266,0.0015,7.159,6170,H,0.273,1.775,0.0477,0.0552,0.0016,12.261,2100,I,55.569,6.402,0.1220,0.3398,0.0019,45.056,3036,J,41.111,9.093,0.1565,0.3762,0.0329,32.595,4274,K,29.234,6.305,0.0941,0.1591,0.0231,17.237,4607,L,17.413,7.170,0.1130,0.1732,0.0231,19.725,4853,M,51.764,6.022,0.1285,0.4012,0.0115,41.608,1890,N,12.093,0.899,0.0285,0.0408,0.0015,9.695,3766,不同有机氮源培养基中无机盐含量及对应红霉素效价,本实验运用,SPSS,软件中的快速聚类分析方法（,K-Means Cluster Analysis,）对无机盐进行了分析，将各种无机盐含量分成高低两类。,根据聚类分析结果可以将各种无机盐高低两个水平下对应的效价分成两类。这两类效价之间是否存在显著差别，即各种无机盐的高低两个水平对效价的影响是否显著，本实验用两独立样本,T,检验进行了分析。,发酵培养基,发酵培养基,其中,A,N,表示各种氮源组合，*号表示,T,检验结果存在显著差异。,高水平类,低水平类,高水平类对,应平均效价,低水平类对,应平均效价,极差,显著性,P,值,钾,A B C E,F I J M,D G H,K L N,4122,4550,428,0.663,镁,A B C E F,I J K L M,D G H N,4244,4461,217,0.841,锌,A B C E F,I J L M,D G H,K N,4203,4490,287,0.778,铁,A B C D,E I J M,F G H,K L N,4182,4470,288,0.77,铜,A B F J,C D E G H,I K L M N,5758,3725,2033,0.04*,磷,C E F,I J M,A B D G,H K L N,3257,5092,1835,0.042*,无机盐聚类分析结果及,T,检验结果,发酵培养基,聚类分析结果的验证,发酵培养基,A,：黄豆饼粉,3%,；,B,：黄豆饼粉,3%+0.01%,无机磷,C,：黄豆饼粉,3%+0.02%,无机磷,磷对红霉素效价的影响,发酵培养基,A,：蛋白胨（进口）,1.57%,B,：蛋白胨（进口）,1.57%+0.035mg%,无机铜,C,：蛋白胨,(,国产,)0.74%+,蛋白胨,(,进口,)0.78%,D,：蛋白胨,(,国产,)0.74%+,蛋白胨,(,进口,)0.78%+0.035mg%,无机铜,铜对红霉素效价的影响,发酵培养基,通过以上铜和磷的添加实验，我们证实磷含量的变化对红霉素效价确实存在显著影响，而铜含量的变化对效价并无显著影响。可见聚类分析的结果虽不是百分之百正确，但对实践还是有较高的指导作用，通过它我们很快找到了影响红霉素效价的关键因素。,