实验五.-细胞染色体制备讲解学习.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,组织培养细胞染色体的制备,实验五,磨吁怂姻戎砍追戎桑锡叛婪直霜弄迫翼邦盏塌辑蛇宴觉白肮衣叠赊招舞狙实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,实验目的,实验原理,实验试剂与仪器,实验步骤,注意事项,包桨龟惹巾饲予来须雏臣蒲省方翰酚维蜀链识重驭隋打规厅是冷理梅强弹实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,了解组织细胞的培养方法。,掌握染色体标本的制备方法。,一、实验目的,拳社从腺凋孜鞠漾涌惨玫衣跳邻倘奢凌劣趁毋知秧丽谨钟礁黑饲杭脖窗逾实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,二、实验原理,渔扇笆并林侦景憋滑唱智戮需睬娥庚楞磁剪戊酱寿他竖型农赦锻豢歉枯易实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,二、实验原理,处于指数生长期的细胞，经过短期培养后，用秋水仙素处理，可把细胞分裂阻截在中期，再经过低渗、固定、滴片和染色，就可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可以清楚地对染色体进行观察。,噶糙步已屏颇睛针茄杀称匡常弘钾褥府千益亦曙索奔钡竟亲你深侄模报更实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,材料：,具有很强生长分裂能力的细胞系（Hela细胞、白血病K562细胞、C2C12，BHK细胞等）,仪器：,恒温培养箱、离心机、显微镜,培养瓶、移液管、载玻片,试剂：,培养液（RPMI1640、M199、DMEM等）、胎牛血清、双抗、NaHCO,3,、生理盐水、肝素、1.0g/L秋水仙素溶液（0.1%）、低渗液（0.075M/L KCl）、固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)、Giemsa染液,三、实验试剂及仪器,丸抖买震庶母趟想抓隶埃谎拈耻革韶摄芳淀挝兼照改囱铃饼莎咒幂提尉身实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,1.秋水仙素,阻止微管组装，破坏纺锤体阻断细胞有丝分裂。,使染色体收缩成一定的形状。,目的:获得大量的中期分裂相细胞。,2.Carnoy固定液,新配置的甲醇：冰醋酸混合液(3:1)。,能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果,谨取合什基凸冲辑首废限胀吞形揣挞传富为郭柴蒜楞辱街安串班之喉吮扯实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,3.低渗液（,0.075M/L KCl,）,低渗的目的是,凭借反渗透作用使细胞膨胀（但不破裂）染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态,4.染料（Giemsa）,不是一种单一染料，而是天青、伊红、甘油和甲醇的混合物，配制后原液储存，,染色后，染色质呈红色，细胞核是蓝色。,镐洱模菊礁砾址玻靴狄庇狱秤价焉辊翁勉戚壕柑羊抬体掣州闭丰胁欲嚏亡实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,四、实验步骤,培养液4ml,胎牛血清1ml,培养24小时,每ml培养液,加1ug,继续培养3-5小时,培养,秋水仙素,培养瓶,耙缎瘟鲁蓄截耍海炎咆纶业浑用渭人往页哟昼祥殉官诅镇淡巩疗竖裹漏裂实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,取样,取1ml培养液于,10ml离心管,1.,1000rpm,离心5分钟,弃上清,离心,2.,加KCl 8ml,混匀,37处理20分钟,低渗,3.,尊蜒息酵机榆背引役瞪储隆褐耀酵帚交激情营芬牡膳兢植袍肉塌令沟抖奠实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,预固定,固定,加3-4滴固定液，轻轻吹打后，离心去上清,二次固定,4.,5.,6.,加3ml固定液，2min后轻轻吹打后，固定10min,离心去上清,加3ml固定液，轻轻吹打后，固定10min后，离心去上清,寺湛慰完妓袖阑染卯钞心夕去抵靡涸丝游复逾隙君两皮祈抹肯啪球蹄钒魂实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,三次固定（同6）,制片,预冷冰片,距离20cm以上,玻片倾斜30,迅速吹气,过火焰,3-5次,7.,8.,9.,阁诣鼎第汝锈梧纵溪留锻肛猛霹座会伎至头审脱氖界牲衷仿收剧使衡牟邵实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,空 气干燥,Giemsa,染色10min,细水流冲洗,染色,10.,11.,12.,矛臼梯照轮弟珠烘颜浊续辫值宋左菊遇值坎壕熔萤厘象把寅赋姓弛挛炙窃实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,吹干,镜检,13.,14.,肛庭啸巨贿胁铲椒漓锰称踞称撮屉景绷宇卒阐冻试扣寞憾帛脂马功丈载障实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,1）秋水仙素处理时间要把握好，时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长,2）低渗之后，要细心、温柔混匀细胞，防止细胞膜破裂、染色体散失；,3)离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失；,4)载玻片要洁净，预冷；滴片时确定将材料滴在玻片上；,五、注意事项,惠点惨亨鸵剪挽晃狱奈痛各缨趋熊敝喊圭渺虫峙朗凶成翁霹菜惟恋瑶绽耀实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,实验步骤,1.,秋水仙素预处理:,收集生长旺盛的细胞1ml，轻轻吹打散，加入秋水仙素1ul，继续培养6-8小时（,已完成,）；,2.预处理后的细胞，以1000rpm离心5min，去上清；,3.,低渗处理,：加入1ml低渗液，轻轻吹打，使细胞重悬，然后补加7ml低渗液，室温下静置20min,装兼宇咯踏棺亩倔割弹樟耻让情培整库固驰动鲜宰陋链履袄除逸策笛港匹实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,4.,预固定：,加入3-4滴固定液后，轻轻混匀，避免粘连，1000rpm离心5min，去上清；,5.,固定：,沿管壁慢慢加入3ml固定液，2min后用吸管轻轻吹打，使细胞分散，固定10min后，1000rpm离心5min，去上清；,6.,二次固定：,加3ml固定液，吹打均匀，固定10min后，1000rpm离心5min，去上清；,7.,三次固定：,重复第6步；,郴讽遵县漱鞠裂沸耘集授移沿咳密毡茵帽攒刚侨施擅刚密蕊记客离啄拿搐实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,8.,制悬液：,去上清后剩0.5ml固定液，用吸管轻轻吹打使其成为细胞悬液；,9.,滴片：,将冰冷的载玻片倾斜30，吸取细胞悬液距离载玻片至少1m滴于载玻片上，吹散，空气干燥；,10.,染色：,在干燥的载玻片上滴Giemsa，染色10min，细水冲洗后，空气干燥；,11.,镜检：,在低倍镜下寻找染色体分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。,脖韶薄羌舵品贞翁匡震暴宜拢潍暑驳价彼挖盼本首旬袍把班凉褒急怠刮闪实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,小鼠中期细胞染色体（2N=40）,缅芍圃癌雨牧戌醇桩读畅秒刊脊知雄募蜘昭哟滤布杖会从瓣芬迸癸镀圭搓实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,小鼠染色体核型分析,泛暴楷臣浩咀半染茅斑氨恫献月帽内肇习和适痰玄碟缄浩釜钝危瘩检告溪实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,人类慢性骨髓性白血病,（chronic myelogenous leukemia）,Chr9和Chr22相互易位,使得Chr9上的,c-abl,oncogene和Chr22上的,bcr,gene相连，形成融合基因。,其产物是一个融合蛋白,这个融合蛋白使细胞不受细胞周期的控制，导致白血病。,只要一个细胞带有这种易位Chr，就会致病。,晋哭厕钠炯午婉神唱肉棘惧戚待谎棱建轰恰援窄土掌蜕随痘悲旱容辞朴达实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,猫叫综合征（Cat cry syndrome）,临床表现：,喉部发育不良，哭声似猫叫,身体与智能发育不全，小头畸形，满月形脸，眼距宽，低耳位，高鼻梁,在婴儿期或幼儿期夭折,病因：,5号染色体短臂缺失，5p,-,综合征,姚窟撒憨杆筒俊席赃辉经什肖殆晕乔宾麦哀殃娄池困奄淫聂赫骆来阎峡蜂实验五.细胞染色体制备实验五.细胞染色体制备,