r干扰素释放试验检测方法培训PPT文档.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,-,干扰素释放试验（,T-SPOT.TB,方法）,技术培训,1,培训内容,1,2,3,4,T-SPOT.TB,技术原理,T-SPOT.TB,检测试剂、组份,T-SPOT.TB,技术操作流程（,SOP,）,T-SPOT.TB,操作常见问题,2,-,干扰素释放试验（,IGRAs,）,两种,IGRAs,用于商业诊断：,T-SPOT,.,TB,(ELISPOT-based IGRA),QuantiFERON,-TB Gold(ELISA-,based IGRA,),3,结核杆菌感染者体内存在特异的效应,T,淋巴细胞。,当效应,T,淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会大量分泌,IFN-,直接检测,IFN-,或者检测分泌,IFN-,的效应,T,淋巴细胞可用于,诊断是否有结核杆菌感染。,（隐性感染即存在活菌,/,存在效应,T,淋巴细胞）,-,干扰素释放试验（,IGRAs,）,4,T-SPOT.TB,技术原理,基于,ELISPOT,技术，计数分泌,IFN-,的效应,T,淋巴细胞数目,+,抗原,5,T-SPOT.TB,基于外周血单个核细胞（,PBMC,）的,ELISPOT,技术,，敏感性更高。,每例样本同时检测,4,个孔：,阴性对照孔,(N):,无任何抗原刺激,TB,抗原孔,(A):,ESAT-6(panel A),TB,抗原孔,(B):,CFP-10(panel B),阳性对照孔,(P):,植物凝集素抗原,(PHA),(,刺激所有,T,细胞都能释放,r-,干扰素,),6,IGRA,中特异结核抗原,ESAT-6,:Rv3875,编码,结核分枝杆菌早期分泌抗原,CFP-10,:Rv3874,编码,结核分枝杆菌,培养滤过蛋白,10,RD-1,(,M.TB,毒力区,),Rv3871,Rv3879,Rv3874(CFP-10),Rv3875(ESAT-6),结核分枝杆菌基因组,结核杆菌,RD,区特异抗原：,试剂盒中结核抗原：,ESAT-6,和,CFP-10,的重叠肽段,7,T-SPOT.TB,检测试剂、组份,无血清培养液,AIM-V,（分装使用）,可拆卸,96,孔板（,8,连条）,特异抗原,A,和,B,（,ESAT-6,和,CFP-10,）,阳性抗原,PHA,抗体、显色液,组,份,T-SPOT.TB,检测试剂盒,8,其他试剂,无菌,Ficoll,淋巴细胞分离液,（,建议分装使用,）,1 PBS,洗液（,pH7.2-7.4,）：,可配置,10PBS,母液，稀释使用，,0.22um,滤膜过滤灭菌,双蒸水或去离子水,（高压灭菌或,0.22um,滤膜过滤灭菌）,细胞培养液：,建议分装使用,RPMI1640,培养液,台盼蓝染液（,0.4%,）或其他细胞染色液,所有试剂使用前提前,1-2h,平衡至室温（抗原可适当减少平衡时间）,9,T-SPOT.TB,操作流程,Procedures:,6ml,250,000 cells/well,Ficoll,10,第一步：采血,推荐使用：肝素,/,肝素钠,/,肝素锂抗凝管,(,提问,:4ML,采血管可行吗,?,回答,:,更改为,6ML),样本采集后,4,小时内分离外周血单个核细胞，,室温放置，请勿置于冷冻或冷藏室。,11,第一步：采血,免疫低下,/,受抑制成人,成年人或,10,儿童,2-9,岁儿童,2,儿童,6ml,静脉血,8ml,静脉血,4ml,静脉血,2ml,静脉血,12,第二步：单个核细胞（,PBMC,）分离,1000g,，,22min,务必缓降,45,度角,缓慢加入淋巴细胞分离液,中间白膜层,按照,血液：,Ficoll,淋巴分离液,=2,3:1,轻缓加于,Ficoll,淋巴分离液上层，,注意不能够将血样与分离液混合,。室温下（,18-25,），,1000 RCF(g),离心,22,分钟。,13,第三步：收集,PBMC,生理盐水洗涤,1,次,(,也可用,1640),，,18,，,600g,，,7min,RPMI1640,培养基洗涤,1,次,18,，,350g,，,7min,500ulAIM-V,培养基重悬,吸取,中间白膜,层并转移至无菌,15ml,尖底离心管，,生理盐水和,RPMI1640,培养基各,洗涤细胞,1,次,，,弃上层液，加入,0.5ml AIM-V,培养基重悬细胞。取适量混匀的细胞悬液适当稀释后进行细胞计数,。,14,第四步：计数细胞,血球计数板人工计数,细胞计数仪计数,调整,PBMCs,浓度：,2.5*10,6,cell/ml,需要,500ul,（,100ul,*,4,孔）,每,ml,细胞数量,=,细胞计数,稀释倍数,10,4,15,第四步：计数细胞,计算公式：,需要的细胞悬液量,(ml)=,每个培养孔需要加入细胞数量,/(100,000),需要使用的细胞稀释液量,(ml)/,计数的每,ml,细胞数量,(10,6,/ml),。,所需细胞悬液：,A,（,ul,）,=,（,2.50.5/,细胞计数）,1000l,补加体积（,ul,）,=500-A,注：手工计数细胞数不得低于,50,个；,机器计数不得低于,2.510,6,/mL,。,16,第五步：铺板,可拆卸板（按样本数取出相应条数）,25,万个细胞,/,孔,（,100ul,）,细胞培养箱（,37,度）,16-20h,（过夜）,避免交叉污染、混匀细胞悬液,17,第六步：洗板,200ul 1PBS,垂直冲入,倒扣培养板，甩干液体,纸巾上拍打干净,反复洗涤,6,次，,个别红细胞残留孔，反复冲洗至无肉眼可见颜色。,18,配置抗体,（多配,1-2,个样本量）,加入抗体，,4,度孵育,1h,加入显色液（避光,5-7,分钟）,第七步：抗体孵育、显色,19,第八步：读板,CTL,AID,固定读板人员和读板仪器,20,T-SPOT.TB,结果判读,斑点相减,A,B,C,D,20,通常正常结果，空白对照孔没有或很少斑点（,20,个。,21,T-SPOT.TB,结果判读,N,孔斑点数,P,孔斑点数,T,孔,-N,孔斑点数,结果判定,10,任何值,任何值,不确定,5,20,任一孔,6,阳性,两孔均,5,阴性,19,任一孔,6,阳性,两孔均,5,不确定性,6N10,20,任一孔,N,阳性,两孔均,N,阴性,19,任一孔,N,阳性,两孔均,N,不确定性,空白对照孔斑点数为,0-5,个，且（抗原,A,或抗原,B,斑点数）,-,（空白对照孔斑点数）等于,5-7,时，此结果被认为是,“,灰区,”,。,22,T-SPOT.TB,有效斑点,斑点特点：,1,、圆形，实心、有核结构,2,、大小不均一,特异性斑点,非特异性斑点,23,T-SPOT.TB,有效斑点,斑点数在阳性阈值上下的，务必人工辅助判读。,24,常见问题小结,1,、外周血处理,-PBMCs,问题,潜在可能,可能解决方法,细胞量少,白细胞减少症,增加采血量,错误的血液收集,不能使用含有,EDTA,的采血管,采血管放置温度不是,18-25,确保采血管放置温度是,18-25,血液存储超过推荐时间,确保血液存储在,4-6,小时内,红细胞污染,采血管放置温度不是,18-25,确保采血管放置温度是,18-25,错误的离心分离,增加离心时间到,30min,调整离心机,降速到最缓和,淋巴细胞分离液效果欠佳,更换淋巴细胞分离液,没有明显或清楚的单个核细胞层,离心速度过低,增加离心速度到,1500-1800g,离心时间过短,增加离心时间到,30min,淋巴细胞分离液效果欠佳,更换淋巴细胞分离液,高血脂标本,采集空腹血液标本,结果无效,无效结果可能由许多不正确的标本处理情况引起，也可能由污染引起。,上面提到的部分,保证试剂无菌,保证操作无菌,25,常见问题小结,2,、斑点和,PVDF,膜,问题,潜在可能,可能解决方法,PVDF,膜背景高,洗板不充分,增加洗板次数及浸泡时间,(6,次,),PVDF,膜没有充分干燥,PVDF,膜彻底干燥后再进行斑点读取。,PBMCs,洗涤不干净或破碎,重复洗涤，吹打细胞沉淀不暴力,PBMCs,细胞混有较多红细胞,采集血样后室温保存并,4,小时内处理，,更换淋巴细胞分离液，,必要时进行红细胞破碎处理,(,蒸馏水,),。,显色时间过长,实时检测显色过程，适时终止反应。,孔中出现空白区域,细胞分布不均匀,细胞培养时避免剧烈晃动或拍板；,溶液加样时避免气泡产生,斑点不清晰,细胞孵育时细胞移位,细胞培养时避免培养板震动，以免斑点“拖尾”,26,27,北京胸科医院所用耗材,独立包装,1ml,无菌吸管,15ml,无菌试管,28,分离效果图,29,谢 谢,!,30,