siRNA和miRNAPPT文档.ppt

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的生成、结构和功能大约可分为以下几类：,6,RNAi的研究历程,7,2025年4月29日,8,1995，RNAi现象首次在线虫中发现。,1998，RNAi概念的首次提出。,1999，RNAi作用机制模型的提出。在线虫、果蝇、拟南芥及斑马鱼等多种生物内发现RNAi现象。,2001，RNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现象。RNAi 技术被Science评为2001年度的十大科技进展之一。,至今，蓬勃发展，成为分子生物学领域最为热门的方向之一。,2025年4月29日,8,8,内容纲要,一、RNA干扰及其机制,二、MicroRNAs在发育中的调控作用,三、RNAi与异染色质,四、miRNA 在癌症发生中的作用,五、siRNA的应用,9,2025年4月29日,10,RNA干扰（RNAi）是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA(double strand RNA,dsRNA)导入细胞后,能特异性地降解该mRNA,从而产生相应的功能表型缺失,由于RNAi发生在转录后水平，所以又称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing,PTGS）。,RNA干扰是一种重要而普遍表观遗传的现象。,2025年4月29日,10,一、,RNA,干扰及其机制,10,RNA干扰的发现,1.1990年，Rich Jorgensen将由强启动子控制的Chalcone synthase gene转入淡紫色的矮牵牛花-加深紫色,2.Hypopigmentation:许多花出现杂色，甚至紫色消失，变成白色,3.Co-suppression,11,RNA干扰：线虫,1.1995年，Su Guo and Kenneth J.,Kemphues，线虫,2.利用反义RNA技术阻断线虫中的par-1,基因。在对照实验中给线虫注射正义RNA,以期观察到基因表达的增强。,3.然而，正义RNA和反义RNA都能够有,效地抑制基因的表达！,4.沉默的效应能够在被注射的动物及其后,代中保持，虽然RNA转录本在胚胎早期就,发生降解。,12,双链,RNA,与其序列同源的基因的表达,13,RNA,干扰,1.“RNA Interference”:注,入dsRNA能够有效地、长期,的阻断基因的表达,2.给线虫喂食表达GFP,dsRNA的细菌，线虫的GFP,表达被抑制(a)，但存在,RNAi缺陷的则不被抑制(b),3.之前的正义RNA抑制基因,表达的现象，可能是由于体,外转录所得RNA中污染了微,量双链RNA而引起,14,植物免疫系统,1.植物细胞可以通过降解病毒RNA 的方式来对抗,病毒的入侵，称为转录后沉默(PTGS),2.外源基因诱导的RNA沉默是植物对抗病毒和转座,子的一个防御系统,3.绝大多数的植物病毒具有单链RNA基因组，进入,细胞之后从释放其基因组，由病毒编码的RNA,polymerase产生正义和反义的RNA，并形成,dsRNA，触发RNAi机制从而抵制其自身的序列,15,RNA干扰的过程,1.从双链RNA产生的小干扰RNA可以用不同机制关闭基因的细胞机器,2.为什么外源的dsRNA能够抑制与其序列同源的基因的表达？,16,RNA,干扰的分子机器,1.Dicer:RNase III类似的，包含多个功能结构,域的核糖核酸酶，将dsRNA切割成小的short,interfering RNAs(siRNAs)or microRNAs,(miRNA)，并将这些产物加载到RISC上,2.RISC(RNA induced silencing complexes),(RNA诱导的沉默复合体):包含多个蛋白质的复,合物，将与之连接的siRNA或miRNA定位到其靶,点并抑制靶基因的表达。,17,Dicer,序列的结构组成:,1.一个PAZ结构域，与,dsRNA的末端结合,2.两个RNase III结构,3.其他的功能结构域,18,Dicer,1.PAZ有一个OB折叠，与,ssRNAs的3端有较弱的亲,和力，允许PAZ与dsRNAs,露在外面的两个核苷酸结合,2.Dicer的PAZ结构域能够,识别Drosha切割的产物末,端,19,Dicer,的三级结构,1.PAZ,结构域与两个具有催化活性的,RNase III,结构域分离,2.PAZ,结构域与,RNase III,结构域的距离为,65A,，与,25,个,bp,的,RNA,长度一致,3.Dicer,是一个分子尺，负责识别,dsRNA,并在特异位点切断,20,RISC,21,Argonaute(AGO)：RISC的核心成员,1.Argonaute(AGO):大的蛋白质家族，为RISCs的核心成员,2.AGO蛋白质一般包含PAZ和PIWI两种功能结构域,3.PAZ与双链siRNA 3-端露出的两个核苷酸结合,4.PIWI负责将双链siRNA切成单链,5.PAZ和PIWI对于siRNA与底物mRNA之间的相互作用是必须的，并负责底物的断裂或转录抑制,6.不同的AGO具有不同功能，例如人类AGO2负责的RISCs能够割裂底物mRNA，而AGO1和AGO3则不能,22,siRNA介导的mRNA割裂,23,RISC的加载与激活,24,RNA干扰,1.dsRNA首先需要被Dicer相关的复合物进行处理，然后在Argonaute相关的复合物的引导下发挥功能；,2.Dicer和Argonaute家族的成员在RNA诱导的沉默通路中发挥功能，不同的组成通过不同的机制引起沉默,3.例如，不同的Argonaute相关复合物能够引起不同的沉默过程(mRNA降解vs.翻译抑制),25,小干扰,RNA,（,small interfering RNA;siRNA,）和微小,RNA,（,microRNA,；,miRNA,）是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子，是小,RNA,的最主要组成部分，它们的相关性密切，既具有相似性，又具有差异性。对小,RNA,的深入研究将使我们更深一步了解生命的奥秘。,26,27,miRNA,结构：21-25nt长的单链小分子RNA，5端有一个磷酸基团，3端为羟基，由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。,特点：具有高度的保守性、时序性和组织特异性。,27,27,28,28,m,iRNA,介导的,RNAi,28,miRNA的研究起始于时序调控小RNA（stRNAs）。1993年，Lee等在秀丽隐杆线虫（,Caenorhabditis elegan,）中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin-4。2002年，Reinhart等又在线虫,C.elegan,中发现第二个异时性开关基因let-7。2001年10月science报道了三个实验室从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似,C.elegan,的lin-4的小RNA基因，称为microRNA。随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细胞增殖，甚至是肿瘤发生。,29,What are microRNAs？（1）,miRNA是广泛存在于真核生物中的一组短小的、不编码蛋白质的RNA家族，它们是由19-25个核苷酸（nt）组成的单链RNA（3端可有12个碱基长度的变化）；,miRNA的表达具有组织特异性和阶段特异性。即：在不同组织中表达有不同类型的miRNA,在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA表达；,编码miRNA 的基因可位于基因组的非编码区，以及编码蛋白质基因的内含子、外显子和非翻译区。这些基因在基因组中成簇排列或分散排列。,30,What are microRNAs？（2）,miRNA具有,高度保守性,，即各种miRNA都能在其他种系中找到同源体；,miRNA独有的特征：其5端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C,miRNA执行一定的,生物学功能,：,对与其互补的mRNA表达水平具有调节作用；,一些偏大的miRNA可能参与了基因组的重组（27nt）；,31,miRNA的成熟,据体内外实验研究表明miRNA的生成至少需要两个步骤：,1）由长的内源性转录本（pri-miRNA)生成70nt左右的miRNA前体（pre-miRNA)，该过程发生在细胞核;,2)将pre-miRNA加工为成熟miRNA，该过程发生在细胞质中。,32,Structure of pri-miRNAs,(A)pri-miRNAs的结构,(B)人类pri-miR-30a RNA,的发夹环；Drosha切割位,点(箭头)，Dicer切割位点,(三角),33,Pre-miRNA,Pre-miRNA,是由内源性基因间区或内含子的DNA反向重复序列转录而来,它是一种长约70nt的非编码RNA,具有茎-环结构也即发夹状结构。,Pre-miRNA在Dicer的作用下可被剪切成miRNA,miRNA 只是pre-miRNA 茎中的一个臂,34,miRNA的加工,1.Pri-miRNA被Drosha切割,2.pre-miRNA被Dicer切割,3.Exportin 5(Exp5)将,miRNA装运到胞质中,35,Drosha vs Dicer,1.RIII,RNase III,催化结构域,;D,dsRNA,结合结构域,;,PRORICH,proline-rich,结构域,;RS-RICH,arginine/serine rich,结构域,2.Drosha,和,Dicer,都具有,RNase III,和,dsRNA,结合结构域,36,37,MicroRNAs的多样性,1.miRNAs发现的数量近年来快速增长,2.2006年10月，miRBase 9.0，收录4361个具有发夹结构的前体miRNAs，能够表达出4167个miRNA产物,3.Release 12.0，收录8619个具有发夹结构的前体miRNAs，能够表达出8273个miRNA产物,38,MicroRNAs的多样性,拟南芥：187,154,152,人：695！,39,miRNA与靶mRNA的作用模式：,1）二者不完全互补，即二者不完全配对结合时，主要影响翻译过程（阻遏翻译）而对mRNA的稳定性无任何影响。这种miRNA是目前发现最多的种类。如线虫的lin-4。,2）二者完全互补，即二者完全配对结合后，类似siRNA与靶mRNA的结合，特异性的切割mRNA。如miR39/miR171,当miRNAs 和编码蛋白质的mRNA 几乎完全配对时，miRNAs 诱导RNA介导（RNAi）的干扰途径。,3）上述两种模式均具备。当其与靶mRNA完全互补配对时，直接靶向切割mRNA，而不完全互补配对时起调节基因翻译的作用。如let-7 果蝇/线虫。,40,miRNA,的调控特点,交叉调节：,动物,miRNA,与靶,mRNA,之间的不完全配对使得任何一,个,miRNA,都可能作用于不同的,mRNA,，一个,mRNA,也可能受到多个,不同,miRNA,的调节。,自我调节：,自我调节参与了,miRNA,的生物合成和功能。例如,参与,miRNA,生物合成的一些酶也受到其产物,miRNA,的调节。,Dcl1 mRNA,编码一种植物,Dicer,蛋白参与,miRNA,的生成,同时它也是,miR2162,的靶分子。,可逆性调节：,miRNA,所致的翻译抑制在某些条件下是可逆的。当,mRNA,作,为,miRNA,抑制的靶分子后,mRNA,会被送至胞浆内的,P (Pbodies),重新定位。,41,miRNA,调节方式的优点,与蛋白水平的调节相比，更加节省能量,与转录水平调节相比，,miRNA,调节更迅速，而且是可逆的,内含子所编码的,miRNA,是一种对基因组资源的高效利用,42,microRNA,基因组分布,60%,独立表达,15%,成簇表达,25%,的,miRNAs,位于内含子,43,植物与动物,miRNA,的区别,动物,植物,前体茎环结构,短，简单,长，复杂，折回长度变,异明显,加工过程,作用机制,先在细胞核，后在细胞质 仅在细胞核中,大部分作为翻译阻遏子，大部分介导靶,mRNAs,小部分导致靶,mRNAs,降解,的,降解,长度,保守性,22-23nt,高,21nt,更高,44,经典理论：,2008 Nature,45,小结,miRNA,的作用是多种多样的,它既可以通过关闭一些关键,基因来改变细胞的命运，也可能与其靶基因产物相互作用,形成调节环并与其他调节通路交织作用形成网络调控机制。,大多数,miRNA,并非独立作用,而是参与到复杂的基因调控网,络中。,据推测,人类三分之一的,mRNA,都被,miRNA,调控,随着它们的,作用机理逐步明了,相信将会给人类带来更多的福音。,46,由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA（注：病毒入侵，或者是自身合成RNA中出现错误，细胞内就会产生双链RNA，来阻止这些异常基因的表达）。,siRNA,47,在Dicer酶的作用下，这些双链RNA被加工成20-25nt的siRNA，而后这些siRNA被组装进入一种RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencing complex，RISC，由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割）。最后，这些siRNA与靶mRNA分子互补配对，并引导RISC剪切、降解RNA分子。,因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。,48,49,siRNA,siRNA结构：21-23nt的双链结构，序列与靶mRNA有同源性，双链两端各有2个突出非配对的3碱基。,siRNA功能：是RNAi 作用的重要组分，是RNAi发生的中介分子。内源性siRNA是细胞能够抵御转座子、转基因和病毒侵略,的,屏障,。,49,49,50,50,siRNA,介导的,RNAi,50,51,siRNAi,的特点：,高效性和浓度依赖性,特异性,位置效应,时间效应,细胞间,RNAi,的可传播性,多基因参与及,ATP,依赖性,51,51,小干扰,RNA,（,small interfering RNA;siRNA,）和微小,RNA,的异同点,52,miRNA,与,siRNA,的作用机制：,53,2025年4月29日,54,2025年4月29日,54,相同点/联系点,siRNA,miRNA,长度及特征,都约在22nt左右，5端是磷酸基，3端是羟基,合成的底物,miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的,Dicer酶,依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点,Argonaute家族蛋白,都需要Argonaute家族蛋白参与,RISC组分,二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠；产生了on target和off target的问题,作用方式,都可以阻遏靶标基因的翻译，也可以导致mRNA降解，即在转录水平后和翻译水平起作用,进化关系,可能的两种推论：siRNA是miRNA的补充，miRNA在进化过程中替代了siRNA,54,不同点/分歧点,siRNA,miRNA,机制性质,往往是外源引起的，如病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生，属于异常情况,是生物体自身的一套正常的调控机制,直接来源,长链dsRNA,发夹状pre-miRNA,分子结构,siRNA是双链RNA，3,端有2个非配对碱基，通常为UU,miRNA是单链RNA,对靶RNA特异性,较高，一个突变容易引起RNAi沉默效应的改变,相对较低，一个突变不影响miRNA的效应,作用方式,RNAi途径,miRNA途径,生物合成，成熟过程,由dsDNA在Dicer酶切割下产生;发生在细胞质中,pri-miRNA在核内由一种称为Drosha酶处理后成为60nt的带有茎环结构的Precursor miRNAs(pre-miRNAs)；这些pre-miRNAs在转运到细胞核外之后再由Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs；发生在细胞核和细胞质中,Argonaute(AGO)蛋白质,各有不同的AGO蛋白质,各有不同的AGO蛋白质,互补性,（complementarity）,一般要求完全互补,不完全互补，存在错配现象,RISCs的分子量不同,siRISCs,miRISCs/miRNP,55,各自的生物学功能不同,抵抗病毒的防御机制,沉默那些过分表达的mRNA,保护基因组免受转座子的破坏,对有机体的生长发育有重要作用,重要特性,高度特异性,高度的保守性、时序性和组织特异性,作用机制,双,链的siRNA结合到RISC复合物中，引导复合物与mRNA完全互补，通过其自身的解旋酶活性，解开siRNAs，通过反义siRNA链识别目的mRNA片段，通过内切酶活性切割目的片段，接着再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。同时，siRNA也可以阻遏3UTR具有短片断互补的mRNA的翻译（off target）。,成熟的miRNAs则是通过与miRNP核蛋白体复合物结合，识别靶mRNA，并与之发生部分互补，从而阻遏靶mRNA的翻译。在动物中，成熟的单链miRNAs与蛋白质复合物miRNP结合，引导这种复合物通过部分互补结合到mRNA的3UTR（非编码区域），从而阻遏翻译。除此之外，miRNA也可以切割完全互补的mRNA。,加工过程,siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂,miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解。,对RNA的影响,降解目标mRNA；影响mRNA的稳定性,在RNA代谢的各个层面进行调控；与mRNA的稳定性无关,作用位置,siRNA可作用于mRNA的任何部位,miRNA主要作用于靶标基因3-UTR区,生物学意义,siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染,miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达,不同点/分歧点,siRNA,miRNA,56,57,二、,MicroRNAs,在发育中的调控作用,1.lin-4 和let-7 miRNAs调控线虫发育的时间点,58,lin-4,在幼虫发育过程中的作用,在线虫的幼虫发育期，lin-4下调LIN-14和LIN-28蛋,白质的浓度，从而一方面阻止后期发育，一方面促,进幼虫的发育,59,lin-4,：不完美的剪辑配对,60,miRNA gene discovery,1.Forward genetics:,lin-4&let-7,2.Reverse genetics:,miR-181,mir-273,61,lsy-6,和,mir-273,决定神经细胞的分化,1.Asymmetric chemosensory neurons,（非对称的化学感应神经元）,：ASE left(ASEL)and ASE right(ASER),感受环境的化学刺激,2.ASEL表达gcy-7,ASER表达gcy-5，化学受体,62,miRNA,在脊椎动物发育中的功能,63,miR-124a,和,miR-1,的功能,1.在Zebrafish,Medaka,Mouse,和Fly中表达,miR-124a和miR-1,2.miR-124a仅在鱼和鼠的脑以及脊髓中表达，在,果蝇的腹神经索中表达,3.miR-1仅在小鼠的肌肉和心脏中表达,4.miR-124a和miR-1的序列保守性高,64,65,miRNA,控制植物表型特征,jaw-D的突变对TCP基因表达的影响,66,67,miRNA,调控造血干细胞的分化,1.3种miRNA控制造血干细胞向淋巴细胞的分化过程：miR-181，miR-223，miR-142s,2.miR-181:主要在小鼠骨髓的B-淋巴细胞中表达,3.miR-223:骨髓原细胞,68,69,病毒编码的,miRNAs,70,病毒编码的,miRNAs,71,SV40,编码的,miRNAs,1.,降低细胞毒素,T,淋巴细胞,(cytotoxic T lymphocytes),识别裂解的能力,2.,病毒早期转录肿瘤抗原,(T,antigen),3.,在转录后期，,SV miRNAs,结合早期的肿瘤抗原，并使之降解,4.,降低肿瘤抗原的浓度，从而降低细胞毒素,T,淋巴细胞识别的可能性,72,腺病毒的VA1 RNA,1.Adenovirus virus-associated 1(VA1)RNA.,2.在核里与其它前体miRNA竞争与exportin-5的结合，竞争与Dicer的切割,3.干扰免疫应答,73,宿主,miRNA vs,病毒基因组,1.宿主miR-32与primate foamy virus,(,灵长类泡沫病毒,),type 1 结合限制其扩增，病毒的Tas能够抑制该过程,2.肝特异性的miR-122能够与HCV,(,丙肝病毒,),结合，使其扩增，可能是激活病毒的复制，或者改变其亚定位,74,三、,RNAi,与异染色质：,Fission yeast,1.RNAi调控异染色质的沉默与组蛋白H3K9的甲基化;,2.在fission yeast中删除argonaute,dicer等基因，破坏RNAi机制，发现动粒附近的异染色质重复片段表达异常的转录本,3.由H3K9的甲基化缺失导致转录激活，损伤动粒的功能,4.动粒的重复片段，其转录沉默的状态由H3K9的甲基化以及染色质与Swi6结合所决定。,75,RNAi,促使异染色质化,1.RNAi的分子机器对动粒重复片段的异染色质化的起始和维持是必须的,76,1.,动粒反链的转录片段被,RNAi,沉默并降解,2.,动粒正链转录本低表达，被,Rdp1,扩增并产生,siRNA,3.Rdp1,与染色质结合，促进,siRNA,介导的组蛋白修饰,RNAi,促使异染色质化,77,异染色质的形成,1.,重复片段相关的,siRNA,(rasiRNA),通路：,2.,重复片段的双链的相对的启动子转录，形成长链,dsRNA,3.,由,Dicer,切割成,siRNAs,4.,与,RISC,结合，引起同源,DNA,的沉默,5.,确立沉默的状态，引发,DNA,甲基化和组蛋白甲基化，并招募异染色质结合蛋白质,78,RNAi与异染色质：植物,1.dsRNA与染色质沉默密切相关,2.植物的转基因被同源dsRNA的表达所沉默，并使同源DNA区域发生甲基化,3.由siRNA介导，甲基转移酶能够被招募到靶基因的位点,79,四、miRNA在癌症发生中的作用,1.人中已发现695个miRNAs，命名为：has-miRx,2.miRNA在癌症发生中表达谱的变化:检测334个哺乳动物样本中的217个miRNAs的表达情况,3.与正常组织相比，miRNAs在肿瘤中的表达显著的下调,4.与mRNA相比，miRNA的表达谱是一个很好的癌症分类指标,80,miRNA,调控癌基因的表达,1.c-Myc调控的miRNA控制E2F1的表达,2.c-Myc是一个具有helixloophelix的亮氨酸拉链的转录因子，调控人类和果蝇基因组中约1015%的基因的表达,3.c-Myc激活人类13#染色体上成簇的六个miRNAs,4.E2F1是一个转录因子，在c-Myc的下游，促使细胞周期的发生,5.E2F1的表达受到miR-17-5p和miR-20a的负调控,81,c-Myc诱导miRNA的表达,1.Tet:tetracycline(四环素)，降低c-Myc的表达,82,c-Myc诱导miRNA的表达,1.+/+:,野生型,2.-/-:c-Myc,敲除,3.-/-(Myc):c-Myc,敲除,后再转入外源,c-Myc,基因,83,miRNA：肿瘤抑制因子,1.p53调控miR-34ac的表达,2.在DNA损伤以及癌基因压力的情况下，通过依赖于p53的通路中诱导,3.在肿瘤及其分化的细胞株中过表达miR-34能够抑制细胞周期的过程,84,miRNA,：可能是致癌基因,1.mir-1792的基因簇在人类B细胞淋巴瘤中扩增，与正常细胞相比，其表达量明显上调,2.mir-1792的基因簇与c-myc协同作用，促进小鼠中B细胞淋巴瘤的生长,3.从造血干细胞中分化的肿瘤表达mir-1792的基因簇的一部分，阻止细胞凋亡，是c-myc诱导的淋巴瘤中广泛存在的想象,85,mir-1792基因簇,1.46个淋巴瘤样本和47个直肠癌的样本vs.正常组织,2.mir-1792基因簇表达明显的上调,86,87,五、,siRNA,的应用,1.siRNA一般2123bp:19bp的双链互补区，两边对称的、伸出的序列，5-phosphate(P)and 3-hydroxyl(OH)基团.,2.正义siRNA的5端稳定性较高，3端稳定性较低，切割位点稳定性也较低,88,siRNA,设计的原则,1.mRNA的ATG下游50-100bp，最好75bp,2.效率较高的siRNA设计模体:AAN,19,TT,NAN,19,NN,NARN,17,YNN,NANN,17,YNN,3.50%GC含量(30-70%),4.尽量避免三个连续相同的核苷酸，尤其是GGG,5.避免序列上已知是mRNA结合蛋白质位点的部分,6.使用BLAST搜索核酸数据库，以保证其唯一性,89,siRNA,的设计,1.,将外源的,siRNA,转入细胞中,(,暂时的表达,),化学合成,:,较贵,2.,使用,T7,启动子体外转录前体,miRNA,体外表达的,dsRNA,能够被大肠杆菌的,RNase III,或,RNase III-like DICER,所切割,在细胞或者动物模型中表达,siRNA,3.,使用,pol III,启动子表达,siRNA,90,siRNA,的设计,91,利用,Pol III,启动利用启动子表达,hairpin RNA(shRNA),1.U6,或,H1,的,RNAP III,启动子，终止信号,TTTTT,2.,在各种组织中都能够有效地表达,shRNA,3.(a),将互补的,hairpin RNA(HP),构建到一起；,(b),分别构建，转录后形成双链,92,哺乳动物中,siRNA,载体的构建中,siRNA,载体的构建,93,人类细胞中,siRNA,载体的构建,94,siRNA,的应用,1.,产生在长时间内可被观测的表型,2.,设计在体外或体内稳定的细胞系，在异种移植,模型中，检测血管生成、肿瘤细胞迁移的可能性,3.,快速的在转基因小鼠中建立亚等位基因,4.,将,shRNAs,与已知的、高效的基因投递装置结,合，形成有效的基于,RNAi,的治疗方案,95,RNAi体内合成用各种载体的比较,96,RNAi激活免疫应答通路,97,RNAi,的应用,98,总结,1.RNA interference:siRNA,miRNA以及RNAi的分子机制,2.miRNAs的功能:动物的生长发育等,3.miRNA在癌症发生中的作用:biomarker,作用机理,4.siRNA的应用:产生siRNA的方法，siRNA在基础研究以及治疗方面的应用,99,