sanger测序培训最终.ppt

单击此处编辑母版标题,*,上海吉凯基因化学技术有限公司,Shanghai Genechem Co.,Ltd.,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版标题样式,*,上海吉凯基因化学技术有限公司,Shanghai Genechem Co.,Ltd.,单击此处编辑母版标题,上海吉凯基因化学技术有限公司,Shanghai Genechem Co.,Ltd.,上海吉凯基因化学技术有限公司,Shanghai Genechem Co.,Ltd.,单击此处编辑母版标题,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版标题样式,*,上海吉凯基因化学技术有限公司,Shanghai Genechem Co.,Ltd.,单击此处编辑母版标题,*,sanger,测序,-,基因检测的金标准,曹尚志,1,sanger,测序原理,Sanger,测序的基本流程,测序结果的分析,双脱氧末端终止法,引物设计,实验流程,上机测序,怎样分析结果,问题峰图分析,2,ddNTP,被加到正在合成的链上，由于它的,3-OH,已被氧化，下一个,dNTP,的,5-,磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止。,在引物等延伸反应过程中，,ddNTP,在不同位置掺入，产生了一系列不同长度的新的,DNA,片段。,5,3,5,3,一、,Sanger,测序原理,双脱氧末端终止法,3,一、,Sanger,测序原理,双脱氧末端终止法,4,二、Sanger测序的实验基本流程,（以,MTHFR(RS1801133),检测为例）,1.,根据,rs,号得到位点信息及目标序列,2.引物设计,3.,测序,PCR,模板的制备,4.测序样品的制备,5.上机测序,5,1.,根据,rs,号得到位点信息及目标序列,6,+,2.1 primer primer 5.0,2.引物设计,7,2.2,引物特异性检查,2.引物设计,8,避免3端错配,Your Text Here,避免荧光标记,测序引物长度,16-25bp,，,TM,值,50-65,为宜,55,最佳,测序引物位置避免,Poly,（,A.T,）和高,GC,结构,测序引物位置距离位点最多,600bp,，至少,50bp,不能使用兼并引物测序,引物纯度（,PAGE,纯化方式）,2.3,设计引物还需,注意,9,3.测序PCR模板的制备,根据合成回来的引物浓度稀释，一般工作液,10umol/ul(4,保存,),，母液,100umol/ul,（,-20,保存,）,1.PCR,扩增三步法：变性,-,退火,-,延伸,2.,退火温度：,(Ftm+Rtm)/2-5,3.,延伸时间：,1kb=1min,根据设计好的参数，设置使用,PCR,仪器扩增,.,3.1 PCR,扩增,稀释引物,设计方案,pcr,仪扩增,10,依赖于,PCR反应的优化程,PCR产物的质量,选择最佳的纯化方法,纯化的意义,纯化（试剂盒）,方式选择,1.,柱纯化：用于特异PCR产物纯化或存在100bp的非特异产物的纯化(如：引物二聚体),2.,切胶回收：,可用于任何质量的PCR产物纯化切下条带，去除非特异PCR产物和引物二聚体,3.2 PCR产物纯化,去除,PCR,反应液的残留,1.,残留的引物：保证引物特异性，避免多重测序,2.,残留的,dNTP:以保持dNTPs/ddNTPs的最佳比例,3.盐成分：避免抑制测序酶活性,4.非特异PCR产物：避免扩增出同源性区域,11,测序,PCR,酒精/EDTA/NaAc法,：,去除残留的BigDye Terminator(染料峰),测序产物脱盐,纯化好的测序产物比较稳定,测序产物纯化,4.测序样品制备,测序,PCR,（以回收,PCR,产物为模板）：96,1 min,-,(96,10 sec,-,50,5 sec,-,60,4 min)x 25循环,-,4,保温,12,13,测序,PCR,与普通,PCR的区别,14,5.上机测序,p,cr,扩增仪器中,95,变性,4min,。,.,5.1,测序样品变性,5.2,上机操作,15,三,、,测序结果分析,怎样,看测序结果,怎样得到位点基因型,常见峰图介绍,保证测序结果的准确性,16,峰图判断三要素：,电泳图,(,Electropherogram,),、,峰图,(Raw)、,QV,值,峰图,电泳图,/QV,值,1.怎么看峰图（分析软件Sequence Analysis）,17,Raw,：峰图,Electropherogram,：电泳图,18,QV,值,QV值越高，读图越准确。,QV值为蓝色，表示可信。,QV值为黄色，表示不准确，需要人工判读。,QV值为红色，表示不可信,QV,值,19,根据得到位点信息，将位点,3,保守序列（,10,个碱基左右），在软件中,Chromas,查找，前面即为突变基因型。,PS:,如果是反向引物测序需要将测序结果反向互补,2.怎样得到位点基因型（分析软件Chromas）,20,正常及无信号、信号弱测序峰图,样品内部结构影响及测序峰图,测序仪器影响及测序峰图,纯化因素影响及测序峰图,引物质量影响,及测序峰图,3.常见峰图介绍及分析,21,正常峰图（有完整峰型、单一峰尖锐独立、,QV,值基本上为蓝色,),Electropherogram,：,Raw,：,22,无信号（无完整峰型、无信号或信号值较低、峰图杂乱无章、绝大部分不可信）,Raw,：,Electropherogram,：,23,信号弱（有较完整峰型、信号值较低、峰图部分可信）,Raw,：,Electropherogram,：,24,正常及无信号测序峰图,样品内部结构影响及测序峰图,测序仪器影响及测序峰图,纯化因素影响及测序峰图,引物质量影响,及测序峰图,3.常见峰图介绍及分析,25,poly（A、T）结构导致后双峰,返回,Electropherogram,：,Raw,：,26,测序信号中断（二级结构导致）,返回,Electropherogram,：,Raw,：,27,序列结构高GC导致信号衰减,返回,Electropherogram,：,Raw,：,28,正常及无信号测序峰图,样品内部结构影响及测序峰图,测序仪器影响及测序峰图,纯化因素影响及测序峰图,引物质量影响,及测序峰图,3.常见峰图介绍及分析,29,峰图出现断层（可先重跑看是否解决，需要换Buffer）,Electropherogram,（电泳图、,QV,正常）,Raw,：,30,毛细管堵塞导致拖尾（可先重跑看是否解决，或者清理毛细管）,Electropherogram,（展开图正常）,Raw,：,31,毛细管堵塞导致宽峰（可先重跑看是否解决，或者清理毛细管）,Electropherogram,：,Raw,：,32,正常及无信号测序峰图,样品内部结构影响及测序峰图,测序仪器影响及测序峰图,纯化因素影响及测序峰图,引物质量影响,及测序峰图,3.常见峰图介绍及分析,33,染料峰（纯化操作不规范或者,ddntp,过量）,返回,Electropherogram,：,Raw,：,34,正常及无信号测序峰图,样品内部结构影响及测序峰图,测序仪器影响及测序峰图,纯化因素影响及测序峰图,引物质量影响,及测序峰图,3.常见峰图介绍及分析,35,引物降解或者不纯,Electropherogram,：,Raw,：,36,Thanks,！,37,