67色谱聚焦亲和色谱8演示课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 色谱(层析）聚焦,Chromatofocusing,第一节 概述,据生物分子,pI,的不同，在动相中动速不同进行分离（适于水溶性的两性分子）,特点,：,.,自动形成,pH,梯度，不需特殊实验装置；,.蛋白质聚焦自身,pI,范围，有浓缩效应，峰宽达0.04-0.05,pH,单位，分辨率很高,。,1,2,3,4,5,6,第三节,PB,与,PBE,一、,PB（polybuffer）-,多组分缓冲液,为分子量不同的多羧基多氨基化合物,（两性电解质性缓冲剂）,特点：,.,I,不高，但缓冲力强；,.缓冲能力是均匀的。,7,二、,PBE(polybuffer exchange),多缓冲交换剂,以交联琼脂糖,Sepharose CL-6B,为基质，并在糖上通过醚键偶合上配基而成,如低聚乙烯亚胺,要求：,确保很宽的,pH,范围有均衡的缓冲容量。,8,第四节 实验要点,步骤,样品,pI,的查阅或测定,选,PBE，PB,和起始缓冲液,装柱，平衡,安装仪器（增,pH,计）,加,PB,少量入柱,9,加样,加,PB,洗脱,再生,PBE,洗脱液 脱,PB,一、,PBE，PB,和起始缓冲液的选择,.,查,pI,或测定,.,由,pI,确定,pH,梯度范围,最大范围 33.5,10,为提高,Rs,选择的,pH,范围应含要分离样品,pI，,并使其有2/31/2的柱长的吸附解吸时间。,.,由产品性能表选择,.,PBE94,.,选始缓冲液,pH9.4，,乙醇胺-,HAC,（0.025）,.选,PB96,用,HCl,调,pH7.0,11,二、,装柱,.,PBE,量,由样品量确定,PBE,量,一般100,mgpr/10ml,床体积、每,pH,单位,.,柱选择,H/D=3060,.,充填（同前）,.,平衡,用始缓平衡，要求：,.,缓冲液使用前应先脱气，以除去其中,CO,2,.,需平衡到进出液,pH、I、,电导都一样。,.,校验,柱装好坏，用有色的牛细胞色素,C,检查。,12,三、,样品,.,V,S,因聚焦浓缩效应，,V,S最大可达50%2,V,t,但最好0.5,V,t,.,I0.05,.,加样,要求：,.,上样前应先加5,mlPB，,以免,.需使样品均匀平整加在床面上,13,四、,洗脱,.,洗脱剂用量,pH,取决于洗脱剂浓度,梯度 浓度大，峰间距小,范围 浓度小，峰宽大,梯度体积 一般：1213,V,t,14,.,流速,一般线速在3040,cm/hr,.,检测,主要是目的物浓度、,pH,五、,PB,的除去,1.,沉淀法：加硫铵，再透析,2.凝胶过滤：常用,Sephadex G-75,15,六、,再生,一般：.先除去吸附的杂质,对,pI6，,在柱顶，可用1,mol/LNaCl,对,pI,很小，可用0.1,mol/LHCl,.,用起始缓冲液平衡,七、,保存,24%乙醇,16,八、,结果讨论,.顶替（取代）效应,带电量除与,pI,有关，还与滴定曲线有关，,B,在,pH,更高才被吸附,（如下图所示）,静电荷,+,-,A,B,pH,p,H,洗脱,V,I,I,pH,17,后期,I,的增加,出现竞争性结合,影响,B,类分子的吸附,造成,B,类分子提前洗脱,.陶南效应（阴,IE）,因表观,pI,下降，出现滞后洗脱。,.溶解度,造成滞后洗脱,因,pH pI,时,S，,往往需更低,pH,时，其,S，,才被洗出。,18,第五节 技术的应用,蛋白质类（包括酶）的分离,蛋白质类（包括酶）等电点测定,P175-177,19,第七章 亲和色谱,Affinity Chromatography,AC,第一节,概述,原理,利用生物体中许多高分子化合物具有和某些相对应的分子可逆结合的特性建立的色谱法。,一、,特点,高效、高收率、有浓缩效应，使用局限性,20,二、,应用,高效从复杂混合物中得某一种物质；,基于生物功能可把有活性与无活性分开,三、,基本过程,须找配基（它与底物专一可逆结合如下图）,21,22,亲和层析法的作用原理示意,23,说明：,1.,偶联用,Gel（,须是活化偶联介质）,2.,亲和吸附剂 高度专一亲和吸附剂,类专一亲和吸附剂,3.,按相互作用力划分：,次级键亲和色谱,配位键螯合色谱,共价键共价色谱,疏水键疏水色谱,24,亲和层析的必要条件,:,合适的配体（配基、,ligand),合适的载体（,Matrix),合适的吸附和洗脱条件,25,第二节,亲和色谱配基(,ligand L,),作为配体的条件,亲和力大,;,具有解离平衡,;,与载体偶联不失活,常用系统,酶,:,底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物,核酸,:,互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物,激素,:,受体、运载蛋白,抗体,:,抗原、病毒、细胞,外源凝集素,:,多糖、糖蛋白、细胞,26,配体的浓度,一般使用较高的固定化配体浓度,配体亲和力高，且本身带电则浓度须降低,配体浓度过高引起色谱畸变。,(,与很多物质发生非特异性结合,),27配体的选择,1.考虑亲和势,L+S LS,K,l,=LS/LS,要求,K,l,在10,-4,10,-8,mol/L,之间,2.与,L,的偶联不破坏,L,与,S,的结合,3.需了解,L-S,的作用机制,如,28,例：酶 有单底物反应、双底物反应,单,A P,E E,EA EP,底物,A、,产物,P,或它们的类似物都可以,29,双底物依次,A B P Q,E E,EA EAB EPQ EQ,须选择,A、,若选,B,则吸附时须加,A,30,双底物随机,A（B）B（A）P（Q）Q（P）,E E,EA EA（B）EPQ,A、B,都可选择,对,A、B,的选择仅取决于它们亲和势的大小和固定化的难易程度。,31,第三节 亲和层析载体,一、作为载体的条件,1.,亲水,2.,惰性,3.,具有活化基团,4.,大网孔,5.,机械性能好,32,二、载体的选择,1.,琼脂糖凝胶：亲水性强，理化性质稳定,（商品名：,Sepharose,）,2.,聚丙烯酰胺凝胶：理化性质稳定，耐有机溶剂及去污剂，抗微生物能力强，特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。,3.,葡聚糖凝胶：有良好的化学及物理性质，孔径小。,4.,纤维素：非特异吸附严重，廉价，易得。,5.,多孔玻璃：物理性能好，有非特异性吸附。,33,三、手臂（,Spacer arm）,在载体和配基间引入适当长度的“手臂”，减少载体的空间阻碍，增加配基的活动度。示意图如下：,34,35,连接臂往往为烃链的疏水性手臂（其长短对吸附的影响大*）或具氨基、羧基的亲水性手臂（其长短对吸附的影响不大）,疏水性手臂具体选择应考虑：,分离物质分子量大小,亲和势大小,过长手臂易弯曲、折叠等,最常用的连接臂有,6-,氨基己酸、,1,6-,己二胺和,3,3-,二氨基二丙胺。,36,37,表7.3,接有连接臂的亲和层析用载体,载体,连接臂,供应商,琼脂糖,3-氨基丙基和琥珀酰氨基丙基,Bio-Rad,3,3-二氨基丙基和琥珀酰二氨基丙基,Bio-Rad,1,2-二氨基乙烷,1-二氨基己烷,3,3-二氨基二丙胺,ICN,1,6-己二胺,6-氨基己酸,Pharmacia,33-二氨基丙基胺,对苯甲酰基-3,3-二氨基丙基胺,Serva,氨基烷基(2,4,6,8,10),Miles,聚丙烯酰胺-琼脂糖,1,6-己二胺,6-氨基己酸,IBF,多孔玻璃,氨基丙基,氨基己基,Merck,38,四、偶联用,Gel,.CNBr,活化型,Sepharose,39,溴化氰对多糖类载体的活化反应,溴化氰活化多糖的配体偶联反应,40,溴化氰法的特点：,活化效率高，速度快，配体结合量大，毒性大。,（废液可用碱性硫酸亚铁中和）,主要影响因素：,活化：,CNBr,的用量，,pH,，温度，时间,偶联：配体的用量，,pH,，温度，时间，封闭,41,42,环氧活化型,Sepharose,环氧氯丙烷法的特点：,活化效率低，速度慢，重复性较差,毒性低，可引入亲水手臂，易操作,43,氨基琼脂糖,羧基琼脂糖,44,五、类专一性亲和吸附剂,.固定化凝集素（本质是蛋白质）,可用来分离糖、糖蛋白 如,.固定化多聚核苷酸,可用来分离,NA、,核蛋白 如,.染料亲和吸附剂,以染料为配基，用来分离酶类、干扰素等,45,46,第四节亲和吸附剂的制备,一、要求,.,L,与基质结合，对,L-S,结合无干扰；,.,L,为小分子有的需“手臂”，使,L-S,结,合更有效；,.非专一吸附不大，以免吸附杂质；,L,与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。,47,二、,偶联用,Gel,的选择,需考虑：,.,L,上可供偶联的基团,.“手臂”,.,L,的稳定,pH,三、由,CNBr,活化型,Sep.4B,制备,商品名：,CNBr-Sepharose,48,一般步骤：,冻干粉 溶胀洗涤 混合反应 掩蔽,溶解,L ,洗去,L（,未结合）成品,49,亲和吸附剂的制备过程,50,.溶胀和洗涤,用1,mol/L HCl,溶胀洗涤除细碎粒子,.,偶联条件,注意：,前处理、偶联密度、缓冲液种类及,pH,.,掩蔽,偶联后有部分氰酸酯未偶联上,L，,常利用含-,NH,2,的缓冲液或含-,NH,2,的分子处理，将其掩蔽。,.洗去未结合,L,用高-低交叉,pH,来洗（45次）,51,四、,由氨基-,Sep,或羧基-,Sep,制备,Sep-(CH,2,),6,-NH,2,L-COOH AH-Sep,Sep-(CH,2,),6,-COOH L-NH,2,CH-Sep,碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：,52,还有多种方法可以完成琼脂糖多糖载体活化和配体偶联过程,如,:,双环氧法等,p140-145,双环氧法制备亲和吸附剂的原理,53,其他亲和吸附剂,聚丙烯酰胺载体的亲和吸附剂可用戊二醛法和肼解法活化,然后再将含氨基的配体固定到其活化基团上,;,硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载体引入氨基或环氧基团,.,54,第五节一般实验方法,是否有类专一吸附剂 有 溶胀,Gel,无,选,L,选偶联,Gel,偶联,L,装柱,55,安装仪器,平衡（23,V,t,）,加样吸附,洗去非吸附物,亲和柱 洗脱液,再生 脱盐,56,一、亲和吸附柱的预备,.亲和吸附剂选择或制备,效能小试：,据资料等先选择始缓冲液种类、,I、pH、t,.,用10,V,t,始缓洗，若目的物未流出，说明吸附性能好，,0.9,.,不断加样到目的物流出，确定吸附容量,.柱,H/D,高度专一 短,类专一 长,平衡 一般23,V,t,始缓,57,二、,加样吸附,.样品平衡（透析或,SephadexG-25）,.,样品体积,Vs（,一般5%）,若结合紧密，,Vs,可较大；不紧，,Vs,要小,.洗去非吸附物（10,V,t,始缓洗）,三、洗脱（以,S,不变性为前提）,类专一：选择性洗脱、有分级分离要求、梯度或阶式洗脱。,58,高专一：,专一洗脱、无分级分离要求、单成分洗脱,.,pH,变化（破坏静电引力）,.,I,变化（减弱静电引力、范德华力）,.亲和洗脱,L,的类似物,L，S,的类似物,S,*,采用酶促反应的多元专一性洗脱,.,表面活性剂,减少疏水作用、范德华力,种类常有：曲通,X100 1%（V/V）、,乙二醇等,59,.,解离试剂,主要破坏氢键，如尿素、盐酸胍等,.降低温度,t,较高,t,吸附、较低,t,洗脱、减少疏水力,.电泳解吸 +,在柱两端连上电极进行电泳,四、脱盐 -,五、再生,60,*采用酶促反应的多元专一性洗脱,三元复合物 两元专一性,负洗脱,E+A EA+B EAB,A,AE A -A,洗脱,A,三元复合物 三元专一性,正洗脱,E+A EA+B EAB,+,A +C,洗脱,C AE,A EAC,A C,EAC,61,E=,乳糖合成酶,A,蛋白,B=,-,乳清蛋白,E+A EA+B EAB,A=N,乙酰,D,氨基葡萄糖,两元专一性实例,负洗脱,62,三元专一性实例,正洗脱,A=NAD,+,B=AMP C=Py E=LDH,63,第六节,其它亲和色谱简介,一、共价色谱,利用形成和破坏共价键能力的差异分离,其共价键常为二硫键,S-S,主要用于分离分子中含巯基的,Pr、,多肽,基本层析过程,64,65,二、疏水色谱,将疏水的,L,连到,Gel,上,作用力蛋白质的疏水区与疏水性配基间 形成疏水键,可高盐上柱，低盐洗脱或高温上，低温洗。,66,三、螯合色谱,原理,His Cys Trp,能与某些金属离子形成复合物，若将金属离子固定，可将含这些外露,AA,的,Pr,吸附。,固定方法：,将环氧活化型,Sepharose6B,与金属螯合剂偶联成配基，再用金属离子处理。如,洗脱：采用增加,I,或降低,pH,或加入,EDTA,原理,67,68,69,四,、有机染料亲和色谱,(p158),原理,有机染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具类似于,NAD+,的结构。一些需核苷酸类物质为辅酶的酶，对这些染料具一定亲和力。,70,第七节 应用（,p161-166),抗体和抗原的纯化,酶的纯化,糖蛋白和脂蛋白的纯化,其它蛋白质,细胞的纯化,71,