MGMT-甲基化试剂盒研发.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,人类MGMT基因（启动子）甲基化检测,(,MSP法,),试剂盒研发项目分享,主讲人：刘骏珲,技术支持：刘旭宏,1,抑癌基因,它可以通过多种信号传导途径以及蛋白,-,蛋白之间的相互影响起作用，影响细胞生长、分化、转移、粘连、增殖及细胞周期，促进凋亡，抑制肿瘤细胞的转移和侵袭。,2,MGMT基因启动子,1.与癌症相关,脑胶质癌,肠癌,口腔癌,肠癌,MGMT基因启动子发生甲基化,3,研发思路,MGMT甲基化检测试剂盒研发,引物的筛选,引物性能的评估,引物优化比例的确定,初步检测体系的建立,多因素优化设计,DNA质控体系建立，甲基化标准品合成,基因残留质控,转化成功质控,98%转化参考品构建,筛选合格样本,甲基化浓度梯度参考品,甲基化水平的检出,检测流程的建立,分析性能评估,检测体系建立,HANDS系统的引入,4,检测位点确定,通过文献调研确定MGMT基因启动子区域,甲基化CpG岛预测并与文献比较,A,CG,AA,CG,T,CG,AAA,CG,CAAAA,CG,TTCTAAAAA,CGCG,共7个潜在CpG位点,5,MGMT甲基化标准品构建,1.确定目标序列，设计引物,2.重叠延伸PCR制备DNA,3.菌液培养,4.浓度标定,5.测序验证,6,DNA重亚硫酸盐转化体系确定,供应商选择,1.天根DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(DP215),2.EpiMark重亚硫酸盐转化试剂盒,3.EZ DNA Methylation-GOLD Kit,转化程序选择,1.98C for 10 minutes,2.53C for 30 minutes,3.53C for 6 minutes OR,4.37C for 30 minutes,5.4C storage（3-4步 8循环）,7,qPCR体系建立,8,三大体系,G体系,针对人类基因组DNA设计,P（非甲基化）体系,根据转化后序列（非CpG位点设计探针）,L（甲基化）体系,覆盖CpG位点（全甲基化）的长探针,9,引物探针设计,HANDS,系统引入,1.,减少引物二聚体,2.,增加结合效率,3.,增加酶切活性,4.,保护碱基,10,HANDS系统,5,3,5,3,11,针对基因组DNA转化模板引物的筛选实验,实验结果表明：F1R2 检测Ct值靠前，扩增效率较高，因此拟采用这对引物作为检测引物,F1R2,F1R1;F1R3;F2R2;F2R3;F3R2;F3R3;F4R2,12,淬灭探针,甲基化长探针,BHQ,FAM,BHQ,13,针对基因组DNA转化模板探针以及引物HAND的筛选实验,实验结果表明：,AT-,F1R2+POBE2检测Ct值靠前，扩增效率较高，因此拟采用这对引物作为检测引物,F1R2+PROBE1,AT-F1 AT-R2+PROBE1,F1R2+POBE2,AT-F1 AT-R2+POBE2,14,反应体系优化,1.体系中Buffer，Mg,2+,引物浓度等优化。,2.添加剂优化：蔗糖，NH,4+,BSA,15,针对基因组DNA转化模板检测体系添加剂体系筛选,实验结果表明：在反应体系中不添加任何添加剂对检测的效果较好;,F1R2+PROBE2,F1R2+PROBE2+20um蔗糖,F1R2+PROBE2+4.6mM NH4+,1R2+PROBE2+K+;F1R2+PROBE2+0.1%BSA,16,分析性能评估,1.特异性考察,2.梯度标准品验证,3.反应体系稳定性,4.灵敏度考察,17,针对实验室保存正常人类基因组DNA转化模板检测应用甲基化检测探针检测其特异性,结果表明，目前合成的甲基化检测谈针对甲基化样品的探针对于临床正常非甲基化样品不能检出，特异性强，而采用非甲基化探针可以检测信号。,18,应用甲基化检测探针检测其MGMT基因甲基化梯度参考品,实验结果表明：目前体系针对不同程度甲基化模拟模板，灵敏度为可以为检测到6copies/ul,400copies/ul,200copies/ul,100copies/ul,50copies/ul,25copies/ul,12copies/ul,6copies/ul,19,针对基因组DNA转化模板检测体系少量临床样本检测,实验结果表明：目前体系可以对临床绝大部分DNA转化液进行MGMT启动子的检测，,只需要一次PCR即能实现检测，不需要巢式PCR,20,针对基因组DNA转化模板检测体系,灵敏度深入考察,8倍 16倍 32倍 64倍 128倍 256倍 512倍,实验结果表明：针对基因组DNA转化模板检测体系，可以检测到转化液稀释512倍相当于基因组拷贝数12,21,质量控制体系的建立,22,参考品构建,98,转化液构建,由,100,人类基因组转化液与人类基因组按比例对参得到,1,：,1,甲基化参考品,由,100,人类基因组转化液与甲基化质粒标准品按比例对参得到,23,应用非甲基化检测探针检测其MGMT基因甲基化梯度参考品,结果表明 梯度稀释的质粒标准品稀释2*10,3,copies/ul在Ct值上与400ng转化人类基,因组相一致，将这2种样品等量对掺相当于甲基化和非甲基化为1：1的标准品,2*10,7,copies/ul-2*10,3,copies/ul,24,应用转化液通检探针检测其MGMT基因甲基化质粒梯度参考品并且对临床正常样本转化液进行初步定量,实验结果表明：目前梯度稀释范围从2*10,10,copies/ul到2*10,3,copies/ul，临床正常样本转化液lCt值位于2*10,3,copies/ul之后，需要进一步定量,2*10,10,copies/ul,2*10,9,copies/ul,2*10,8,copies/ul,2*10,7,copies/ul,2*10,6,copies/ul,2*10,5,copies/ul,2*10,3,copies/ul,临床正常样本转化液,25,应用转化液通检探针检测其MGMT基因甲基化质粒梯度参考品并且对临床正常样本转化液进行进一步定量,结果表明 梯度稀释的质粒标准品稀释40 copies/ul在Ct值上与2.5ng转化人类基因组相一致，将这2种样品等量对掺相当于甲基化和非甲基化为1：1的标准品（50%甲基化参考品）,2*10,3,copies/ul,400copies/ul,临床正常样本转化液,80 copies/ul,16 copies/ul,4 copies/ul,26,甲基化灵敏度,采用,MGMT基因启动子50%的甲基化参考品，按照比例依次稀释,，依次构建,50%,33%,20%,11%,4.7%,2.4%,27,应用甲基化检测探针检测其MGMT基因甲基化梯度参考品对掺正常人类基因组转化液（按照400copies/ul-6copies/ul每一个浓度都加上正常人类基因组转化液）,实验结果表明：目前体系针对不同程度甲基化模拟模板灵敏度为2.4%,以上浓度梯度均加入2.5ng正常人类基因组转化液构成（50%,33%,20%,11%,4.7%,2.4%）,参考品,400copies/ul,200copies/ul,100copies/ul,50copies/ul,25copies/ul,12copies/ul,6copies/ul,28,整体效果,质粒梯度不惨正常人类基因组转化液,质粒梯度对掺惨正常人类基因组转化液,只加正常人类基因,组转化液,NTC,29,THANK YOU,30,完全转化且位点完全甲基化,甲基化长探针,M,非甲基化探针,P,31,3,3,32,