蛋白检测ELISA(课堂PPT).ppt

,原理,类型,试剂准备,对照,标本,结果,蛋白质检测,-ELISA,1,1.,ELISA,的原理,2.,ELISA,的类型,3.,试剂准备,：,免疫吸附剂,结合物,酶底物的准备,4.,对照设定,5.,标本的采取和保存,6.,结果判断,酶联免疫吸附,ELISA,（,enzyme linked immunosorbent assay,，,ELISA,IA,）,。基础,:,抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。,1.,ELISA,的原理,酶联免疫吸附剂测定基本原理是：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。,1.1,抗原抗体反应,1.1.1,可逆性,抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：,Ag+AbAg,Ab,抗体的亲和力（,affinity,），可以用平衡常数,K,表示：,K=Ag,Ab,AgAb,Ag,Ab,的解离程度与,K,值有关。,高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。,解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。,1.1.2,特异性,抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。,测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。,1.1.3,最适比例,1.1.4,敏感性,化学比色法的敏感度为,mg/ml,水平,酶反应测定法的敏感度约为,5-10g/ml,免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿,标记的免疫敏感度可提高数千倍，达,ng/ml,水平,例如，,HBsAg,，其敏感度可达,0.1ng/ml,。,1.4,免疫测定在病虫害检测中的应用,由于各种抗原成份（如病毒的外壳蛋白、细菌的细胞壁蛋白组分和鞭毛等），包括小分子的半抗原（包括植物激素、化学农药等），均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。,2,ELISA,的类型,ELISA,可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：,（,1,）固相的抗原或抗体，即,免疫吸附剂,（,immunosorbent,）,；,（,2,）酶标记的抗原或抗体，称为,结合物,（,conjugate,）,；,（,3,）酶反应的底物。,可设计出各种不同类型的检测方法。,2.2.1,双抗体夹心法测抗原,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于,包被固相载体,和制备,酶结合物,而建立此法。,操作步骤如下：,（,1,）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。,（,2,）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。,（,3,）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。,（,4,）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。,根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。,2.2.2,间接法测抗体,传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用,同一酶标抗抗体,建立检测相应抗体的方法。,操作步骤,1,）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。,2,）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。,3,）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。,4,）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。,2.2.3,竞争法测抗体或抗原,当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。,2.2.3,竞争法测抗原,小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的,位点,，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等,ELISA,测定多用此法。,3.ELISA,的试剂,(A,、,B,、,C,三部分,),ELISA,中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。,（,1,）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；,（,2,）酶标记的抗原或抗体（结合物）；,（,3,）酶的底物；,（,4,）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；,（,5,）结合物及标本的稀释液；,（,6,）洗涤液；,（,7,）酶反应终止液,ELISA,的试剂准备,A,固相载体,聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。,聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。,良好的,ELISA,板应该是,吸附性能好,，,空白值低,，,孔底透明度高,，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间,性能相近,。,3.1.2,包被的方式,将抗原或抗体固定在过程称为包被,(coating),。,蛋白质,与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的,疏水基团,，故更易吸附到固相载体表面。,不易吸附,的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。,亲和素生物素,即用亲和素先包被载体，加入生物素化的,DNA,，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。,脂类物质,无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入,ELISA,板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。,优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的,1/10,乃至于,/100,。,包被用抗原：,天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。,合成多肽抗原,是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。,3.1.4,包被用抗体,IgG,对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在,Fc,段上，抗体结合点暴露于外。,取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液,.,须除去杂抗体后才能用于,ELISA,，以保证试验的特异性。,3.1.5,包被的条件,pH9.6,碳酸盐缓冲液,pH7.2,的磷酸盐缓冲液,pH7-8,的,Tris-HCL,缓冲液。,加入包被液后，在,4-8,冰箱中放置过夜，,37,中保温,2,小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为,10ng/ml-20ug/ml,。,3.1.6,封闭,封闭,(blocking),是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥,ELISA,后的步骤中干扰物质的再吸附。,常用封闭剂：,0.05%-0.5%,的,BSA;10%,的小牛血清或,1%,明胶,;,脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（,5%,）。,3.4,洗涤液,在板式,ELISA,中，常用的稀释液为含,0.05%,吐温,20,磷酸盐缓冲液。,ELISA,的试剂准备,B,3.2,结合物,即酶标记的抗体（或抗原）是,ELISA,中关键的试剂,1,酶的催化活性,2,抗体（或抗原）的免疫活性,3,不含或少含有游离的抗体（或抗原）,4,结合物尚要有良好的稳定性。,3.2.1,结合物用的抗原和抗体,制备结合物时所用纯度较高的,IgG,，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在,ELISA,中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。,3.2.2,酶,纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。,酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。,在,ELISA,中，,HRP,（,辣根过氧化物酶,），,AP,（,碱性磷酸酶,），葡萄糖氧化酶，,-D-,半乳糖苷酶和脲酶等。,3.2.3,结合物的制备,酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。,（,1,）,戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达,60%-70%,）和重复性好。,交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。,（,2,）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将,HRP,分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成,chiff,氏碱而结合。简便有效,.,3.2.4,结合物的保存,酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（,HRP,结合物加硫柳泵，,AP,结合物可加叠氮钠）。,试剂准备,C,酶的底物,3.3,酶的底物,3.3.1,HRP,的底物,OPD,氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在,492nm,处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是,HRP,结合物最常用的底物。,DH,2,+H,2,O,2,D,+2H,2,O,上式中，,DH,2,为供氧体，,H,2,O,2,为受氢体。,DH,2,一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。,DH,2,如：邻苯二胺,(OPD),、,四甲基联苯胺,(TMB),和,ABTS,。,E,TMB,经,HRP,作用后共产物显蓝色。,TMB,性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与,H,2,O,2,溶液混和即成应用液。酶反应终止后，,TMB,产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为,450nm,。,ABTS,虽不如,OPD,和,TMB,敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。,AP,的底物为磷酸酯酶，一般采用对,硝基苯磷酸酯,作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在,405nm,波长处有吸收峰。用,NaOH,终止酶反应后，黄色可稳定一时间。,AP,也有发荧光底物（磷酸,4-,甲基伞酮），可用于,ELISA,作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。,3.5,酶反应终止液,常用的,HRP,反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式,ELISA,中一般采用,2mol/L,。,4,对照设定,阳性对照品,(positive control),和阴性对照品,(negative control),是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。,阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。,加入的量应与试剂的敏感度相称；,在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。,参考标准品,定量测定应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的,4-5,个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中,.,显色,显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。,TMB,受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。,TMB,经,HRP,作用后，约,40,分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至,2,小时后即可完全消退至无色。,比色,拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。,以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。,结果以光密度（,oplical density,，,OD,），现按规定用吸光度（,absorbence,，,A,），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于,A,字母的右下角，如,OPD,的吸收波长为,492nm,，表示方法为,A,492,nm,或,OD,492,nm,。,酶标比色仪,酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读,ELISA,光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到,0.001,，准确性为,1%,，重复性达,0.5%,。,操作时室温宜在,15-30,，使用前先预热仪器,15-30,分钟，测读结果更稳定。测读,A,值时，要选用产物的敏感吸收峰，如,OPD,用,492nm,波长。有的酶标仪可用双波长式测读。,各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。,5,结果判断,5.1,定性测定,定性测定的结果判断作出,“,有,”,或,“,无,”,的回答，分别用,“,阳性,”,、,“,阴性,”,表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。,在间接法和夹心法,ELSIA,中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法,ELISA,中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。,A.,阳性判定值：（,cut-off value,）,一般为阴性对照,A,值加上一个特定的常数,(0.05),，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。,B.,标本,/,阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（,S,）和阴性对照（,N,）的,A,值后，计算,S/N,值。,间接法和夹心法,（,2,）竞争法,因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出,S,、,P,和,N,的吸光值。,a.,阳性判定值法,阴性判定值,=0.4,NCX+0.6,PCX,阳性,A,阳性判定值,阴性,A,阳性判定值,b.,抑制率法,抑制率（,%,）,=,（阴性对照,A,值,-,标本,A,值）,100%/,阴性对照,阳性 抑制率,50%,为,阴性 ,50%,定量测定,ELSIA,操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。,测定大分子量物质的夹心法,ELISA,，标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈,S,形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。,4.ELISA,的操作要点,严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保证,ELISA,必要条件。,严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。,